RNAi技术专刊之五：体外转录合成双链RNA[选购宝典]

生物通技术专刊：RNAi技术专辑之五

在植物、昆虫、原生动物体内都发现了自然存在的RNAi现象，实验表明通过目的基因序列的双链RNA可以诱导产生基因沉默现象。要制备较长的dsRNA，最简单的方法就是体外转录合成双向的RNA。如果研究对象不是哺乳动物细胞，那要开展RNAi的实验就要简单很多。因为可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象，而无需制备特定的siRNA。在这里生物通将介绍几个制备长链dsRNA的试剂盒。（值得注意的是在哺乳动物细胞内，大于29nt的双链RNA引发的是非特异基因沉默，21nt大小的双链RNA，也就是我们前面所说的siRNA能有效引发特异的基因沉默。由于体外转录很难合成25nt以下的短链RNA，生物通在前面为大家介绍了一些利用试剂盒或者质粒合成siRNA的产品。参考相关文章） MEGAscript™ RNAi Kit     合成大量纯净的双链RNA是RNAi实验成功的关键。这个基于专利的转录高产技术的产品正是为大量合成用于RNAi实验的dsRNA而优化的。试剂盒要求用两端带有T7启动子序列的目的基因作为模板（200nt以上，模板可以是质粒载体上的，也可以是用带有T7序列的引物扩增的PCR产物，另外也可以选用一个叫Lig’n Scribe Kit可以将T7 Prometor序列直接连接到DNA片断的两端），将模板和试剂盒提供的dNTP、酶等混合，根据模板的长短进行体外转录反应。每次反应可以合成50ug—100ug甚至更多的dsRNA(800nt以上的需要先加热变性并褪火形成双链)，产量是常规的10—50倍，整个试剂盒总产量可达2mg（20次反应，每次100ug）。合成的产物经过DNase I消化去除DNA模板，再经过特殊的单链RNase（试剂盒里提供，后文介绍）除去单链的RNA，最后经过柱纯化就得到纯的双链RNA，即可用于RNAi实验。由于这个试剂盒提供全套产品，使用相当方便。 Silencing of Drosophila hrp48 and U2AF50 Protein by dsRNA. A. Specific Reduction of Expression Levels. 1 x 106 Schneider’s Drosophila melanogaster L2 cells were grown in 6-well plates in serum-free medium and treated with 10 nM of dsRNA specific for either hrp48 or U2AF50. dsRNA were prepared with the MEGAscript RNAi Kit and post-transcriptionally labeled with Cy3 using the Silencer siRNA Labeling Kit when indicated (+). Cells were harvested 72 hours post treatment and the silencing effect was analyzed by Western blot with anti-hrp48 (48 kDa, migrates as a doublet) and anti-U2AF50 (50 kDa) antibodies. An antibody directed against Pab 1 (lower panel) was used as a second negative control. B. Dose-sensitive Reduction of Protein Expression Levels. dsRNA-triggered silencing of hrp48 was analyzed as in Figure 2a using the indicated concentrations of hrp48 dsRNA made with the MEGAscript RNAi Kit. Western analysis was also performed with the anti-U2AF50 (bottom panel) and Pab 1 (data not shown) antibodies as negative controls. 　 HiScribe™ RNAi Transcription Kit     RNA干涉（RNA interference)是近年产生的研究转录后剪切的一种实验方法。它将目的基因所对应的双链RNA 导入生物体，导致相应的mRNA降解。和反义技术不同的是, 在基因表达恢复之前，RNA干涉现象将持续多个细胞分裂周期， 因而它是一种有力的研究基因功能的工具。它不是传统的在DNA水平基因敲除，而是通过RNA干涉，在RNA水平上去除目的RNA。这样大量基因功能可以快速经济地进行检测。     HiScribe™ RNAi Transcription Kit也是一个体外合成双链RNA进行RNA干涉实验的试剂盒。不同于前者的是，这个试剂盒提供质粒作为载体，方便了以后的扩增和复制。LITMUS™ 载体多克隆位点两端带T7启动子。目的序列插入多克隆位点，利用T7 RNA 聚合酶同时转录DNA摸板的双链，合成双链RNA。载体启动子为T7野生型序列，是已知最强的启动子之一，以保证转录产率的最大化。带有插入lacZ a片段供蓝白筛选。     该试剂盒也可合成单链RNA，在RNA结构研究，核酶化学，体外翻译，RNA蛋白相互作用，反义技术等方面有广泛应用。该试剂盒包含 LITMUS 双向转录克隆载体，适用体外如显微注射、细胞转染和体内RNA干涉在内的所有转录实验。     该试剂盒包括足够的试剂可在2ml的反应体系中合成多至2mg的双链RNA，包括：LITMUS 28i 克隆载体，LITMUS 38i 克隆载体（LITMUS 28i和38i二者只是多克隆位点有所不同），对照载体，T7引物(19-mer), 5´-dTAATACGACTCACTATAGG-3´，10X 含NTP的缓冲液，T7 RNA聚合酶，上样缓冲液和电泳Marker 2-Log DNA Ladder (100–10,000 bp)等等。价格也相当，3750人民币。但是可惜的是试剂盒没有提供消化DNA模版和单链RNA的酶以及纯化的工具，需要另外购置。单独购买的相关产品生物通将在后文继续介绍。更多关于RNAi产品介绍请继续关注生物通技术前沿专栏。 Figure 1: 用带插入子的 LITMUS 28i合成双链RNA Figure 2:  用HiScribe RNAi Transcription Kit体外合成单链和双链RNA。 LITMUS 38i 含1.3 kb荧光酶片段，分别用 PspOM I (P)和Stu I (S)剪切。产生的线形摸板再分别 (P 和 S ) 或一起转录(P/S)，产生单链和双链RNA。琼脂糖电泳1 µl 反应液至少含0.5 µgRNA。 　 相关文章： RNAi——回顾 RNAi研究相关的产品介绍之一 利用试剂盒，自己制备siRNAs或者dsRNA 在细胞内表达siRNA引发基因沉默

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References:

1. Bass, B. L. (2000) Cell 101, 235–238.
2. Fire, A. (1999) Trends Genet. 15, 358–363.
3. Sharp, P. A. (2001) Genes Dev. 15, 485–490