通向基因功能研究的快速之路[选购宝典]

通向基因功能研究的快速之路

　

　

    随着遗传学技术的不断革新，发现新基因的速度远远超过了研究基因功能的速度。确认一个基因的功能往往需要进行大量的功能研究，而各种检测基因功能的方法都可能用到各种各样的表达载体。比如说在体内、体外分别表达基因、选用不同的表达调控系统、进行细胞内定位、采用不同的原核表达、不同的纯化体系等等。就传统方法而言，每次将目的基因克隆到不同的载体都需要花大量的时间用于限制性内切酶消化、连接和检验。如果要研究成百上千的基因，所花费的时间更为巨大。如今，一种快速克隆新技术的出现部分解决了这个问题：无需再考虑亚克隆、限制性内切酶酶切位点、双酶切、阅读框、连接效率等所有传统克隆方法存在的问题，只需要一种酶、一个简单的步骤、很短的时间，即可将目的基因同时克隆到不同的表达载体上。

传统克隆方法的问题

    要将一个基因克隆到每一个载体上，用传统的克隆方法至少需要考虑以下问题：
* 目的基因片断两端的酶切位点是什么
* 是否在每个载体的多克隆位点上都有这两个位点，前后方向是否一致。如果没有相同位点或者方向相反，就要考虑MCS上其它兼容的酶切位点以及目的基因内是否存在这些位点，甚至可能需要补平粘端以进行平端连接。
* 基因片断的插入方向
* 保持正确的阅读框架
* 酶切效率和连接效率
* 电泳和凝胶回收DNA片断
* 购买各种酶的时间和花费
* 筛选和鉴定重组子的时间和花费

新方法

    简单的说，将目的基因按传统方法克隆到一个中间载体上，鉴定。将含目的基因的中间载体分别与配套的表达载体及一种特殊的酶混合保温，转化。重组率高达90%以上。

新方法的优点
    无论是单链或双链DNA，也不需要什么辅助因子，只需要一种酶即可完成上述步骤，重组率高达95%—100%，且无需再鉴定目的基因的方向、读码框架。

原理

    这种方法的原理其实源于一个很早以前的发现：噬菌体DNA可以通过一些特殊的整合酶（或整合因子）的作用，定点整合到大肠杆菌基因组上而不引起细菌裂解，即溶原现象。这种整合是通过噬菌体和大肠杆菌基因组的某个位点重组从而实现定点整合的，需要某种整合因子介导。这个早就已知的现象在不久以前又重新引起注意并由此发展成为一种快速克隆新技术。

    Clontech、LTI（Gibco/BRL）和Invitrogen公司分别推出了三套不同的系列产品，原理不尽相同然而用途颇为相近。究竟他们之间有什么不同？原理是什么？是否适合大家用？是否真如宣传所说的是“克隆技术的里程碑”“代表今后克隆技术的方向”？我们在下面分别作一个简单介绍，如果有对这项技术特别感兴趣的同志还可以到生物通商城中自由地查一下有关报价、download操作手册，细细地研究、好好比较一下再谨慎地作出决定。

一、Clontech公司的Creator系统

    准确的说这更像一个克隆系统，或者说像是一个操作平台：这个系统中有一个中间载体和一系列配套的受体质粒（最终的表达载体），当目的基因克隆到中间载体后，就可以快速高效地将目的基因转移到任意一个配套的受体质粒中，而不用再考虑酶切位点、连接效率、目的基因的方向、读码框架。在这个系统中有一个介导目的DNA定点重组的蛋白叫做Cre，这是一个来源于P1噬菌体、大小为38kDa的重组酶，能够专一识别DNA序列上的loxP位点,并介导该位点上的DNA重组。loxP位点是一段34个碱基的序列，两端是一对13个碱基的反向重复序列，中间是一段8个碱基的Spacer，其方向可以决定外源基因按固定的方向和读码框重组。

                            8-bp spacer region

   ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA T

 Left inverted repeat                 Right inverted repeat

　

   中间载体（pDNR-1,2,3)含有两段loxP位点，之间夹着一段多克隆位点（MCS）和一个反向的氯霉素抗性基因（没有启动子）。另外还有氨苄抗性基因和蔗糖酶基因以供筛选之用。使用这套系统需要先按常规方法将目的基因按正确的方向及正确的阅读框克隆到MCS，经鉴定后得到含目的基因的供体载体(donor vector)。 Creator系统提供三个中间载体可供选择，分别对应三个不同的阅读框架，无需另行调整。

    Creator系列的表达载体（受体质粒）的特定表达元件（Promotor、Enhancer等表达调控区）下游也含有一段特定的loxP序列，目的基因可以通过这一位点重组到表达元件的下游。为了方便筛选，后面还设有另一个反向启动子。

    当用户需要将目的基因克隆到多个表达载体时，只需要将含有目的基因的供体质粒（如图示pDNR）分别和配套的表达载体（受体质粒）混合，加入Cre酶室温放置15分钟，70度保温5分钟，即可用于转化。Cre酶结合两种质粒的loxP位点，解链并介导DNA重组，使目的基因插入到表达载体上，而不会改变目的基因的阅读框架或者方向。

    转化产物用含有蔗糖和氯霉素的选择性培养基进行筛选。当目的基因重组到表达载体上时，由于同时带入一个反向的氯霉素抗性基因，在表达载体loxP位点下游的反向启动子起始抗性基因表达，重组子带有氯霉素抗性。

    由于中间载体（供体质粒）上带的氯霉素抗性基因没有启动子，对应的转化子不能在含氯霉素的培养板上生长。另外供体质粒上还带有一个SacB基因，可以进一步保证这种转化子对蔗糖敏感而不能在含蔗糖的选择性培养基上生存。受体载体没有氯霉素抗性基因，因此只有重组子才能在选择性培养基上生存。这种筛选标记保证了重组率高达95%以上。

    仅仅需要克隆一、两个表达载体，这个系统并不能显示其优越性，因为利用这个系统本身就要经过一次传统克隆。然而当需要同时将一个基因克隆到几个甚至10个载体时，就可以显示出快速克隆的高效性：只需一次传统的克隆，其它的都可以在20分钟内完成，不用再考虑酶切、连接、测序等等问题。甚至连筛选的工作也可以减至最低——因为重组率高达95%以上。

    令人有点遗憾的是，由于受体质粒必须是配套的，并非我们手头任一质粒都可以，因而就不可避免地限制了其应用范围。所以Clontech公司很快又推出了Creator受体质粒构建试剂盒，利用这一试剂盒，用户可以很方便的将自己手头的表达质粒改造成为Creator系统匹配的载体：试剂盒提供一段1kb大小、含有loxP位点和一个反向启动子的片断，客户需要根据自己手头的载体的酶切位点和读码框架设计引物，PCR扩增这段1kb的片断，用内切酶消化后连接到自己的载体上，这样，每个实验室可以根据自己的需要构建自己的配套载体了。

    另外Clontech公司一向以文库和表达系统而著称，旗下的表达系统品种特别丰富，年年都有获得全美R&D100金奖的优秀产品推出，为配合Creator系统，Clontech为旗下包括Tet-On,Tet-Off, 逆转录系统、腺病毒系统、酵母双杂和系统、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、IRES系统等知名度高且广为接受的表达系统推出几十种Creator配套的表达载体，使得Creator系统的广泛应用成为可能。

    钓基因通常要构建文库，从文库中钓到新基因后往往需要进行多次克隆以便研究其功能。Clontech公司将Creator技术引入到著名的SMART建库试剂盒中，推出了Creator SMART建库试剂盒。这个试剂盒的优点是：1.利用逆转录酶的特性，在反转录到cDNA5'帽子结构时将SMART引物转录到cDNA5'端，从而保证PCR扩增出来的是全长cDNA；2.cDNA两端的SMART引物含极为稀少的Sfi酶切位点，因而扩增的cDNA经Sfi单酶切后两端得到不同的粘端（由于该酶识别位点在动物基因组中极为稀少，一般不会导致cDNA被切开），从而保证cDNA定向克隆到建库载体中；3.建库载体含有loxP位点，筛选出来的质粒可以直接作为中间载体，利用Creator技术，在20分钟将cDNA转移到任一表达载体中以研究其功能。这样就进一步为研究人员提供了方便。

   这个系统相比其它同类系统的优点在于：供体载体是以两段loxP位点夹住待转移的基因片断，并将这一片断直接插入受体质粒中的loxP位点中，无需经过供体和受体质粒之间的质粒融合，这样得到的重组表达质粒较小，便于操作。特别是IRES和反转录系统，太大的载体是不适用的。

　

二、Invitrogen公司的Echo系统

    Echo系统和Creator系统非常相似，也是建立在Cre重组酶和loxP重组位点上的，但是Echo的中间载体和受体质粒上都只有一个loxP位点，所以Cre重组酶只能将中间载体和表达载体融合为一个大的质粒。由于较大的质粒不便于操作，插入片断的大小也受较多的限制，所以这个Echo系统在实用性上不如Creator系统。

　

三、LTI（Gibco/BRL）的Gateway系统

    Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到中间载体（这里叫做Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（这里叫做Destination Vector，目的载体）上。 

     Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。 

　

　

　

    在Gateway系统中,中间载体称为Entry Vector，包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccd B基因。由于ccd B基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。在构建含目的基因的中间载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的中间载体以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。

     同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。

    当需要将目的基因从中间载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。attL1序列再和attR1序列重组，融合质粒分解为两个新的质粒，目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发生重组置换，得到一个带目的基因的目的载体（生成新的重组位点attB1、B2）和带自杀基因的中间载体（生成新的重组位点attP1、P2）。反应过程需要25度保温1小时（时间越长，重组率越高，特别是较大的质粒，反应过夜能提高5倍重组效率），蛋白酶K37度处理10分钟，转化。由于带自杀基因的载体不能生长，加上抗生素筛选，转化产物重组率高达90%以上。同样，转化用的菌株必须是不含F附加体的。

　

    由于在这个反应中attL1序列只和attR1序列重组，attL2序列只能与attR2序列重组，这个方向的反应称为LR反应。LR反应生成新的位点称为attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。 在一定的条件下，attP和attB序列也能发生重组，生成attL和attR序列，这个反向反应称为BP反应。

    当用户得到一个含目的基因的Gateway表达载体，希望将目的基因转移到另外几个Gateway表达载体中时，只要先将目的基因从Gateway表达载体中转移到中间载体上，在由中间载体转移到其它的表达载体就行。将含目的基因的Gateway表达载体（attB1—目的基因—attB2序列）与带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列的供体载体（pDONR，注意这个载体不同于中间Entry Vector）混合，加入含有Int、IHF的BP重组酶混合物，25度保温1小时，37度蛋白酶K处理10分钟，根据与上面相同的原理，attP和attB序列也能发生重组，生成带有目的基因的中间载体（Entry Vector）和带自杀基因的表达载体。同样，由于抗性不同以及自杀基因的作用，只有含目的基因的中间载体能被筛选出来。这即是BP反应。需要特别注意的是表达载体如果也是卡那霉素抗性，就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。

    这一特点提供了一种特别的方便：以下列方式合成PCR引物，即GGGG-attB1或者attB2序列（25bp）-基因特异性序列（18到25个碱基或以上），这样在PCR扩增目的基因时就可以直接得到两端带有attB1/2基因的片断。将PCR产物直接与上述的供体载体（带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列）混合，加入BP重组混合酶，25度保温1小时，再37度蛋白酶K处理10分钟，即可转化并得到带有目的基因的中间载体。当然，这个产物最后是需要测序鉴定的，并且，克隆到中间载体的基因不能表达，所以不能用抗体筛选检测。还有一点值得注意的是，由于attB1的末端（第25个碱基）是T，所以跟在后面的基因特异性序列的头两位碱基不能是AA、AG和GA以免提前出现终止密码。

   

    同样的，这种高效的基因转移要求受体载体（Destination Vector）是和Gateway系统配套的，即带有attR1&2和自杀基因片断。可惜的是LTI（Gibco/BRL）公司的并非以表达系统或者文库见长，出售的配套表达载体种类不多也不出名，更加限制了这一系统的应用范围。幸好公司推出了一种带有attR1-ccdB-Cm(r)-attR2的片断，将这个片断克隆到用户自己的载体上，就可以将用户自己的载体改造为Gateway系统匹配的表达载体了，这就大大扩大了系统的应用范围。不过这个片断是平端片断，不但在克隆、连接时比较麻烦，由于带有自杀基因，需要购买一种特殊的菌种DB3.1转化，最后还要通过酶切来鉴定片断的方向。

    值得一提的是由于Invitrogen公司已经成功收购了LTI（Gibco/BRL）公司，而Invitrogen和Clontech一样正是以表达系统出名，目前Invitrogen/LTI已经推出了Invitrogen旗下著名的T-REx表达系统的Gateway配套载体，相信Invitrogen以后会推出更多的能应用Gateway技术的表达系统。

   

    根据厂家提供的技术资料，从个人角度来看，这两个系统比较起来，Creator系统胜在操作简单，反应只需要室温15分钟，70度5分钟就可以转化，反应前不需要将质粒线性化或者开环化，反应后不需要蛋白酶消化；不过可惜Creator系统只提供一种方法——酶切的方法——将基因克隆到中间载体上。

    而Gateway系统则胜在比Creator多提供了两种构建含目的基因的中间载体的途径，即由Gateway配套的PCR产物或者表达载体将目的基因直接转移到中间载体上。问题是Gateway系统操作比较繁，要25度1小时，（较大的质粒要延长时间，反应过夜可以使产物提高5倍），还要用蛋白酶37度处理10分钟。加上LP反应中如果两个质粒都是超螺旋会严重降低重组效率，所以反应前要求将目的载体线性化或者将两个载体用DNA拓扑异构酶开环以提高重组效率，相比就麻烦一些了。另外，这个系统需要买的试剂较多，比如重组酶就要BP、LP酶两种，都要-70度低温保存，还有特殊的菌种、供体载体等等。

    对用户来说最好的是两套系统都提供了有效的方法，可以让用户自行构建与系统配套的表达载体，这样可以说是真正为用户提供了方便，也扩大了应用范围。也许今后的cDNA都可以以克隆到中间载体的形式转让，一旦用户得到一个带目的基因的中间载体，就可以直接将目的基因转移到任何一个他想用的表达载体上而无需考虑酶切图谱、方向、连接效率、大量筛选等问题，这样我们就会有更多的时间去思考更重要的问题，在更短的时间里得到更多的实验结果。