全新的快速诊断技术——生物芯片

　　

作者：老米  2001年12月29日 一、实验室诊断技术发展 十九世纪末临床上开始使用细菌学和血清学检查法，医疗诊断又多了一项实验室诊断技术。一个多世纪来，实验室诊断技术及其诊断仪器发生了飞跃变化，从19世纪的血球蛋白计数到20世纪末的免疫测定技术，从细菌纯培养技术到现在的基因检测，实验室诊断在现代医学中发生越来越起到了不可替代的作用。由于医生、病人对医疗诊断快速性有效性的迫切要求，长期以来科学家们一直在寻找便捷的实验室诊断方法。六、七十年代出现的直接荧光抗体法和气液相色谱法被认为是代替细菌纯培养技术从而作为是对快速实验室诊断技术的有效探索，大约在70年代中期，偶然发现一种在航天技术中使用的自动化仪器可以用来测定尿液中的细菌，开创了体液诊断新路。此后，一物多用的自动化仪器不断增多，新型的免疫学和血清学方法不断出现，体液分析技术发展迅速，使实验室快速诊断技术成为可能。用于实验室快速诊断的方法包括物化方法的气、液相色谱技术、电泳技术和放射测量法以及自动化生化检测技术，免疫方法中的放射免疫测定法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术和免疫胶体金技术等，20世纪末，PCR技术的发展使人类开展基因分析的工作大为简化。随着生物技术和计算机技术的高速发展，快速诊断技术有了更加先进的技术手段如基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室等，专家们预见，在今后一段时间内，生物芯片诊断技术将独领风骚。 二、快速诊断技术集大成者——生物芯片         只要微量的样品，就可以在几个小时内对疾病进行检测，这就是生物芯片将要对疾病诊断发起的技术变革。20世纪90年代初开始实施的人类基因组计划（HGP）取得了人们当初意料不到的巨大进展，而由此也诞生了一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术———生物芯片。严格来说，基因芯片的概念 在80年代初就已经在SBH(sequencing by hybridization)提了出来。90年代初以美国为主开始进行的各种生物芯片的研制，短短10年间，芯片技术获得了迅速发展。目前国外已有十几家专业从事DNA芯片研究的公司，其代表公司为以光蚀刻技术为代表的Affymetrix公司、采用喷墨印刷技术的Incyte公司等等。国内清华大学、复旦大学等的一些实验室也在开展这一工作。     生物芯片主要是指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。目前常见的生物芯片分为三大类：即基因芯片（Genechip，DNAchip，DNA microarray）、蛋白芯片（Proteinchip）、芯片实验室（Lab－on－a－chip）或称微流控芯片（microfluid）等。生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。生物芯片上高度集成的成千上万密集排列的分子微阵列，能够在很短时间内分析大量的生物分子，使人们能够快速准确地获取样品中的生物信息，检测效率是传统检测手段的成百上千倍。使用基因芯片分析人类基因组，可找出癌症、糖尿病由遗传基因缺陷引起疾病的致病的遗传基因。生物医学研究人员可以在数秒钟内鉴定出导致癌症的突变基因。借助一小滴测试液，医生们能很快检测病菌对人体的感染。利用基因芯片分析遗传基因，可以使糖尿病的确诊率达到50％以上。生物芯片在疾病检测诊断方面具有独特的优势，它可以在一张芯片上同时对多个病人进行多种疾病的检测。仅用极小量的样品，在极短时间内，向医务人员提供大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。对肿瘤、糖尿病、传染性疾病、遗传病等常见病和多发病的临床检验及健康人群检查，具有十分重要的应用价值。 三、国内外基因芯片研究动态 生物芯片技术突然崛起引起了世界各国的广泛关注和重视。美国是生物芯片技术最为领先的国家。Affymetrix公司是生物芯片技术的开拓者，早在80 年代末即开始研究光引导的原位合成技术，这一技术导致了第一代生物芯片的诞生。美国政府自1998年正式启动生物芯片计划以来，已有美国国立卫生研究院、能源部、国防部、司法部等政府机构，斯坦福大学、MIT、阿尔贡实验室等著名科研机构，以及Affymetrix 、Hyseq、Nanogen、 Incyte、 Caliper等著名生物芯片技术公司参与该项计划。在过去的十年里，美国在这一领域共投入了近20亿美元，目前第一代生物芯片已进入实用化、产业化阶段，如Affymetrix公司1998年生产出带有13.5万个基因探针的芯片，最近又推出了有40万个探针的芯片。这些芯片可用于检测爱滋病毒抗药性突变以及癌症中P53基因的突变。根据报告统计，，Affymetrix、Apogent和GeneMachines 当前控制着73％的芯片市场份额。 世界各国也纷纷加大投入，英国剑桥大学、欧亚公司正在从事该领域的研究。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。以生物芯片为核心的相关产业正在全球崛起，目前美国已有10多家生物芯片公司股票上市，平均每年股票上涨75％。专家统计：全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右，预计今后5年之内，生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。 我国是从1997年才开始对生物芯片有所了解，正式进入生物芯片研究领域是在1998年，现有20多家科研机构及公司从事生物芯片的开发，主要有清华大学生物芯片中心、上海联合基因科技集团、军事医学科学院、第一军医大学、第四军医大学、东南大学、复旦大学、中科院上海冶金所、中科院上海细胞所、浙江大学等。2000年初国内从事生物芯片技术研究的多家单位联合成立了国家生物芯片技术中心。在第一代芯片研制开发方面，我国已取得一系列的科研成果，如陕西超群公司的SP—GC200型芯片，已获生产批号，可用于乙肝、丙肝病毒以及新生儿疾病的检测；第四军医大学研制了2个大类8个品种20多个规格的生物芯片和芯片阅读机，用于胃病、肝炎、性病等疾病诊断；联合基因公司与第一军医大学合作，在表达谱芯片研制上已达到世界先进水平，并且在广州成功实现了大规模生产，计划到今年年底生产200万片，明年生产1000万片以上 。清华大学生物芯片中心已成功研制出电磁式生物芯片，表明我国在第二代生物芯片的研制上，与发达国家基本保持同步。目前，国内从事生物芯片产业化开发并且已经取得重要进展的企业主要包括上海联合基因科技集团、上海博星基因芯片有限公司、博华基因芯片技术有限公司、北京博奥生物芯片有限公司、深圳微芯生物工程公司、广州功能基因组有限公司、西安高科实业股份公司基因生命科技分公司和陕西超群科技股份公司、浙江江南生物科技有限公司以及上海博德基因开发有限公司与广东肇庆星湖生物科技股份有限公司合资组建的一家生物芯片公司。其中以北京博奥生物芯片有限公司和上海联合基因科技集团规模较大，上海联合基因科技集团目前正准备与帕卡德公司磋商以加强其在生物芯片领域的合作。港台方面，也有香港城市大学已经开发了用于检测的(1)地中海贫血（一种遗传病）；(2)肺结核杆菌及其耐药性（传染病）(3)白血病（癌症）生物芯片。台湾晶宇生物科技公司已研发出肠病毒检验生物芯片。 国内主要芯片研究生产厂家

四、生物芯片种类        生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片和微流控芯片或称芯片实验室。基因芯片是生物芯片技术中发展最成熟、最先商品化的产品，它基于核酸探针互补杂交技术原理而研制。核酸探针是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接上一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。目前，比较成熟的产品有检测基因突变的基因芯片和检测细胞基因表达水平的基因表达谱芯片。基因芯片技术主要包括四个基本技术环节：芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测及分析。目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处理固相基质如玻璃片或硅片，然后使DNA片段或蛋白质分子按特定顺序排列在片基上。目前已经研制出可以将近40万种不同DNA分子放在1平方厘米基片上的高密度基因芯片，并且正在制备包含上百万个DNA探针的人类基因芯片。生物样品的制备和处理是基因芯片技术的第二个重要环节。生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片进行反应。要将样品进行特定的生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA等信息分子并加以标记，以提高检测的灵敏度。第三步是生物分子与芯片进行反应。芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率，从而获取最能反映生物本质的信号。基因芯片技术的最后一步就是芯片信号检测和分析。目前最常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置，经相关软件分析图像，即可以获得有关生物信息。蛋白芯片与基因芯片的原理相似。不同之处有，一是芯片上固定的分子是蛋白质如抗原或抗体等。其二，检测的原理是依据蛋白分子、蛋白与核酸、蛋白与其它分子的相互作用。蛋白芯片技术出现得较晚，尚处于发展时期，最近也取得了重大进展。国际著名Science杂志曾报道了酵母蛋白质组芯片，这是目前为止第一个包含一种生物全部蛋白质分子的蛋白质芯片。相信不久将会有包含更高等生物甚至人类蛋白质组的蛋白质芯片研制成功，并应用于生物医学基础研究和疾病诊断。芯片实验室是生物芯片技术发展另一个重要方向。它将样品制备、生化反应以及检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。例如可以将样品制备和PCR扩增反应同时在一块小小的芯片上完成。再如GeneLogic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA，并对其进行荧光标记，然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。应用自主开发的检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探针具有较大的吸附表面积，可以很灵敏地检测到稀有基因的变化。同时，由于该芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用，所以可以加速杂交反应，缩短测试时间，从而降低了测试成本。目前在应用上使用最多的是基因芯片。 五、生物芯片在诊断上的应用与存在的问题 与传统诊断手段相比，基因诊断能更早发现有关疾病的隐患，也更可靠。1996年，美国Affymetrix公司最先制造出用于药物筛选和实验室研究的基因芯片上市销售。在我国，比较成熟的可用基因诊断的疾病主要是一些遗传性疾病和传染性疾病，如HAV、HBV、HCV、HIV、苯丙酮尿症、血友病及地中海贫血等，基因诊断还可用于胰腺癌等的辅助诊断。生物芯片上集成了成千上万密集排列的分子微陈列，能够在短时间如几分钟内分析大量生物分子，其效率是传统检测手殷的成百上千倍。一些宣传材料描述基因芯片的神奇时称可以一分钟取样，两分钟检测，三分钟出结果。患者检测时，只需把血液或口水滴在基因芯片上，其中的疾病基因就会和芯片上对应的基因发生化学反应而结合，用特制的电脑扫描仪进行扫描后，计算机很快就能识别发生反应的是哪一种疾病基因，从而判断被检测者是患了哪种病。基因芯片的诊断准确而灵敏，不大可能发生漏诊和误诊。随着人类基因组计划不断深入的研究，以及重要病原体、微生物等基因组测序工作的相继完成，为我们提供了更多可供检测的基因，将促进基因诊断向临床应用的快速发展。可以预料，基因诊断将对未来疾病诊断、未来医疗服务模式乃至医疗保险、社会伦理等产生很大影响。 目前我国基因诊断在以下几个方面已进入临床实用阶段： 　　1）人类基因相关性检测。通过基因诊断，可检测胎儿性别，这对与性染色体有关的遗传病的诊断是十分必要的，如新孕儿基因缺陷监测芯片。对于高发性的遗传病，如地中海贫血、镰刀状贫血、凝血因子缺乏等基因诊断已在临床应用多年，而用于器官移植中对免疫排斥反应进行检测的组织相容性抗原基因分型基因芯片正在研制中。 　　2）致病病原体的检测。设计引物和探针，通过基因检测诊断出属于病菌的核酸序列。目前已应用于病毒（乙肝）、细菌（结核）、原虫（梅毒螺旋体）等病原体的检测。 如南开大学研制成功的乙肝病毒基因诊断芯片，能够检测429个亚型。台湾晶宇生物科技公司开发了肠毒素诊断芯片，北京微生物研究所与哈尔滨基太生物芯片开发公司合作的细菌感染通用基因芯片诊断系统是一种广谱的病菌诊断芯片，此外象结核杆菌等致病菌耐药性变异检测DNA芯片等正在研制。 　　3）癌基因的检测和诊断。研究表明部分癌症基因与癌症之间有直接或间接的关系。目前，在临床上可以通过基因检测诊断白血病、肺癌、神经胶质瘤等癌症。除此以外，基因诊断技术还广泛应用于DNA指纹分析、个体识别、亲子鉴别等司法鉴定，动植物检疫以及转基因动植物中阳性基因的检测等方面。 如陕西科林基因工程高科技有限公司的白血病预警芯片，而癌症的早期诊断与肿瘤分型基因芯片、造血系统恶性肿瘤基因分型诊断检测DNA芯片、血液多病毒检测芯片也正在上海等地研制。     基因芯片技术虽有诸多优点，但要成为实验室或临床可以普遍采用的技术目前尚有一些关键问题亟侍解决。主要原因一是基因诊断试剂的研发主要依靠基因组研究成果，需阐明基因与疾病的相互关系，明确核酸序列，然后根据其序列设计引物和探针，进行检测，而目前可用于基因诊断的基因为数不多；二是基因诊断技术操作要求高，不能有任何外源基因的污染，否则检测结果将不准确。三是生物芯片的应用研究大多集中在生物芯片的制备方法等方面，开发出的系统对实验室规模和仪器设备的要求较高、依赖性较强，因此存在如芯片的特异性差、信号检测的灵敏度低、样品制备和标记操作的一体化欠佳等问题。使得这一技术成为实验室研究或临床可以普遍采用的常规方法仍有许多障碍。       在5年左右的时间内生物芯片可能正式应用于临床诊断医疗。乙肝病毒、丙肝病毒和艾滋病病毒基因检测芯片等都已到了临床应用和商业开发阶段。不过，进行基因检测还很昂贵，一个很普通的传染病检测芯片也需一二百元的研发成本，而用国内现有的毛细管PCR技术检测某些传染病，每个人的花费只有十几元钱，且15-20分钟就能出结果。 美国已经有7个生物芯片的上市公司，生产的品种多，但至今没有一家公司的产品获得美国医疗卫生部门的认证。国际上许多著名的大公司都投入巨资开发基因芯片，但到目前为止全世界也还没有实际应用于临床诊断的基因芯片生产。 六、生物芯片的开发应用与市场前景 生物芯片的构思有着严谨的科学理论基础，不断的实验成果也表明其具有强大的生命力。生物芯片无疑有着广阔的市场前景。从理论上来讲，除开器质性的物理损伤和精神损伤以及老化，人类疾病基本上都是同自身和外在病原体的基因有关，少数同异物蛋白有关。对这些疾病的检测经历了从病原表象到病原实质的不断进步，目前越来越多的这类病例已经可以通过基因检测来判断，如甲型肝炎、乙型肝炎、爱滋病及其他一些性病，随着人类基因组测序工程的完成，对人类遗传性疾病基因检测已经是呼之欲出，但目前的基因检测水平还无法完全满足快速准确的要求，因此基因芯片等生物芯片的出现为人类实现快速准确地诊断疾病带来了美好的希望。基因芯片甚至可以囊括一切常规检验和基因检验，更为重要的是，基因芯片诊断技术有着特别的鉴别力，能发现那些貌似健康的人体各种微小的变化，由此可以想象，基因芯片的应用前景与市场前景十分具有诱惑力。 1997年，美国有关传染病诊断、癌症诊断和遗传测试的市场估计达120亿美元,其中基于基因诊断试剂盒所占的市场份额越来越大。根据初步的市场调查,1998年中国传染病诊断的市场大约是30亿元人民币。我国是乙型肝炎发病大国，全球有３．５亿乙肝病毒携带者，我国占三分之一，每年发病率在６０００万人次以上。现在普遍使用的传染病诊断技术都是基于细菌培养或免疫分析的方法，存在明显的缺陷，如检测时间长、专一性问题、基因变型问题、灵敏度问题和假信号问题等，如乙肝病毒基因有着多种类型，不同的基因型之间存在着致病性上的差异，同时病毒基因变异可引起抗药性等不同因此无法分辨病菌的抗药性。此外，很多药物在面对不同的基因组时，相同的药物会有不同的疗效和毒副作用，因而搞清楚病人的基因组成，开发出基因芯片，对于突破传统医疗诊断模式就有决定性的作用。 专家预测到2010年前后，基因芯片技术将渗透到包括医疗卫生在内的日常生活中。今后的医院应该是这样的，每个病人都有自己的‘基因卡’，医生把卡一刷就知道给病人吃什么样的药。 虽然目前生物芯片还没有正式进入临床诊断阶段，但由于它极具诱惑力的市场前景，生物芯片的相关产业正在全球崛起。 美国已有多家生物芯片公司股票上市，而且其股价平均以每年75％的速率上涨。根据前线决策管理咨询公司的最新报告，基因芯片市场包括用于临床实验和研究应用的芯片以及用于制造和分析芯片的相关设备在2000年达到了47亿美元。专家估计，世界范围内的生物芯片市场（包括芯片实验室、基因组分析工具、疾病诊断、司法鉴定及免疫分析）到2001年将达到17O亿美元左右，2010年则有可能上升到600亿美元。用生物芯片进行药理遗传学和药理基因组学研究所涉及的世界药物市场每年约1800亿美元。有报道称扫描仪和芯片点样仪的市场的销售额将以年增长44％的速率增加，到2006年止，将分别达到16.4亿美元和8亿8千7百万美元。同时由于世界范围的研究者使用芯片的比例增加，到2010年每年的混合增长预计有显著增加。 生物芯片目前有70％～80％的经费比率仍使用在研究与开发上，离完全商业化还有不短的一段距离。由于研究开发成本高，因此其市场价格也比较高。在研究开发生物芯片方面较具实力的Affymatrix公司生产的生物芯片单价也非常高，市场推广面临巨大压力。生物芯片涉及领域广，投资成本高，一定程度上制约了其规模化生产。对于资金技术力量比较薄弱的企业，进入生物芯片研制生产存在较大的风险，短期内不会有很大的回报，可以采取技术合作进行参与。鉴于生物芯片还有很多技术难题未能攻破，国内有实力的生物芯片研究单位更要潜心于技术本身的研究，杜绝炒作、只着眼于眼前利益的行为。我们认为生物芯片具有超前的科学意识和巨大的市场潜力，那只是在技术成熟的基础上，可能五年，也可能十年八年，只有谁抢得先机得到了市场的承认，才会得到优厚的回报。生物芯片作为一种快速诊断技术应当不仅仅是人们的一种期盼，它即将走进医院诊所，它的出现必将对未来医疗技术以至人们生活的各个领域产生深远的历史意义和现实意义。 摘自：基因潮