微芯片毛细管电泳测序技术(CAE)前景看好

　　

    从1985年自动化荧光DNA测序仪的问世，到今年所发表的人类基因组序列草图，DNA测序技术已经发展了许多年。其中，毛细管微阵列电泳(capillary array electrophoresis，CAE)的发展提供了一种新型的高速、高通量的测序法。人类基因组目前测序出来的一百四十八亿个碱基对只在短短九个月内便测序完成，使用的即是完全自动化的统ABI公司3700毛细管测序仪(Applied Biosystems ABI Prism 3700 capillary sequencer)，准确率达99.5%。然而，以CAE为基础的DNA测序却仍有其限制。最近的研究则指出，结合CAE和芯片技术(microchip technology)也许可以突破相当多的这些限制，并且还有个附加价值：更高的产量。

    毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)的测序分析，是指在30到50cm长、如头发般薄的毛细管胶片上，分离已用荧光加以标记的PCR产物。近年来在分离用聚合物的型式、组成和品质、产物的准备方法、染料化学及自动化等各方面的进展，已经使此流程更臻完善-一小时便可在一条毛细管内测序出超过1000个碱基。

    操作一排平行的毛细管可以将产量增加许多倍，例如ABI的3700和Amersham公司MegaBACE 1000测序仪均可同时分析96份样品。CAE系统的主要限制在于其产量与分离用毛细管的数量直接成正比，而若是增加毛细管数量，将会导致注入PCR产物和从毛细管处检测信号的灵敏度下降。

    有许多有力的理由支持科学界发展CAE测序仪的微芯片(microchip)装置，其中一点是它们的制造成本相当低。首先，存在于玻璃介质或融合硅介质中复杂的内部微信道(microchannels)，基于其独特的PCR产物注入方式、较短的分离距离和适当的温度条件，故能使DNA极快速的分离。其次，用来创造出这些微信道的光阻成像术(photolithography)有助于加入更多的毛细管，使毛细管的单位面积密度提升得更高，因而能达到一般毛细管数组测序仪所不能达到的高产量。再者，它能让同一列微信道彼此间具有精准的光学定位。最后，由于它整合了产物的处理和分析，故减少了人为干扰而促进自动化，因此更进一步地降低了操作成本。

    于是，微装配CE装置(Microfabricated CE devices，即microchip-based CE，也就是微芯片CE)在1992年首度诞生。一开始用它们来做四色DNA测序的可行性，是先以单一微信道测序来证实，最快可在18分钟内测序达580个碱基，最大读序长度为800个碱基。相当关键的是，Schmalzing等人证明，人类基因组序列(而非一般用的质粒DNA)也同样能获得成功的分析：三十分钟内完成500个碱基。Schmalzing团队亦发现了一项重要事实：若使用该装置则不需要先清理样本(sample clean up)，此与传统的CE相反；后者因对样本中存在的盐浓度十分敏感，故需先对检体做清理。并且，较长的DNA片段在此种装置里不会减少讯号长度-但CE系统就会。因此，以微芯片做高产量的分析获得了强力的支持。

    去年里的重大发展，包括尝试以多信道微芯片(multiple channel microchips)技术来做平行的DNA测序，以及将此流程自动化。由PE Biosystems赞助的Backhouse等人，发展出具有48-188个50公分长独立微信道的微芯片。利用48微信道板，他们的报告表示能解析出超过600个的碱基，正确率98%，上述的表现相当于一条传统圆柱形毛细管的表现。由Aersham Pharmacia赞助的Liu等人，则设计了一个具有16个微信道的CAE微芯片，并有自动注入样本的功能，它能在18分钟内以大于99%的正确率测序500个以上的碱基，这18分钟连芯片的加载与样本的注入时间都计算在内。该项有如机器人般的仪器能自动地预热芯片、将检体从96槽的微价模板(microtiter plates)中以8信道型量管(pipettor)注入到测序仪的16个信道内、将芯片移到检测位置、以电泳分离样本、以共聚焦检测器检测分离好的样本，并将所得数据输出供作分析。

    微芯片CE除了在高产量DNA测序领域散发光芒，它也正被拿来应用到其它方面。已经上市的有”芯片实验室”(lab-on-a-chip)装置(商品有Agilent/Calipers2001 Bioanalyzer及Calipers Automated Fluidics System 90)，它们用来做核酸和蛋白的分析，如分离、计算大小、定量和鉴定DNA与RNA样本。也许最令人兴奋的CE芯片应用法是用于检测特定基因中的序列变异。由人类基因组计划所提供的庞大资源将很快地增强我们鉴定人类致病基因的能力，但在此之前我们亟需低成本、高产量的方法来检测出特定基因里哪些地方出现了序列变异。目前，DNA测序、等位基因特异性PCR(allele-specific PCR，AS-PCR)、单链构象多态性(single-stranded conformational polymorphism，SSCP)分析、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis)、杂交分析以及异链核酸分析(heteroduplex analysis，HDA)是最普遍使用的方法，然而研究者的共同希望是这些方法要能提供更高的产量。最近，SSCP和HDA已发展出微芯片CE系统的版本，并用来检测乳腺癌易感性基因BRCA1和BRCA2的缺失突变、插入突变及取代突变。并且，结合AS-PCR和HDA后置于微芯片CE装置内，可创造出一快速检测特定突变的分析法。

    CE微芯片也被发展来快速检测人类基因组里的单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。SNPs是人类基因变异中最常见的形式，并被认为是做遗传检验、鉴定人类致病基因和发展药物基因学的重要工具。由于利用了酶切突变检测(enzymatic mutation detection，EMD)方法，微芯片CE能够极为精确，无须事先清理检体，并比传统毛细管电泳或胶质电泳快上10倍到50倍。

    在后基因学(post-genomics)年代的此刻，针对多信道微芯片CE装置和整合流程自动化的改良，将无疑地使这项科技成为高精度遗传分析的一种强效高通量的工具。

(arco编辑)