细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展（六）

细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展

博士生: 严明达
导 师: 郑仲承 研究员

　

中 国 科 学 院
上海生命科学研究院
生物化学和细胞生物学研究所

（续前）

2.6 对转录因子的调控

2.6.1 Ref-1激活的转录因子

    从第一部分中对转录因子的氧还调控所作的讨论可以知道，转录因子蛋白保持在活性构象其关键Cys残基的还原态至关重要。而Ref-1就是作为AP-1的胞内还原因子在HeLa细胞核抽提物中被纯化而发现的，后来的研究又揭示了更多的受Ref-1激活的转录因子，现列于表2-2。

表2-2. Ref-1激活的转录因子

转录因子	全称	文献
AP-1	Activator protein 1	Hirota et al., 1997; Xanthoudakis, et al., 1992, 1992b
CREB	Cyclic AMP response binding protein	Xanthoudakis, et al. 1992b
ATF	Activating transcription factor	Xanthoudakis, et al. 1992b
NF-kB	Nuclear factor-kB	Mitomo et a.,l 1994; Xanthoudakis et al., 1992b
Myb	Myb	Xanthoudakis et al., 1992b
Pax-5, Pax-8	Paired box containing family of genes	Tell et al., 1998; Tell et al., 1998b; Tell et al., 2000
HIF-1a	Hypoxia-inducible factor 1a	Carrero et al., 2000; Ema et al., 1999; Huang et al., 1996; Lando et al., 2000
HLF	HIF-like factor	Ema et al., 1999; Lando et al., 2000
PEBP2	Polyoma virus enhancer-binding protein 2	Akamatsu et al., 1997
Egr-1	Early growth response-1	Huang et al., 1993
NF-Y	Nuclear factor-Y	Nakshatri et al., 1996
p53	p53	Gaiddon et al., 1999; Jayaraman et al., 1997; Ueno et al., 1999

    其中Egr-1可被许多生长因子诱导，可能与生长、分化相关，还可以结合到其本身以及Fos、Jun、Ras基因的调控区影响表达；NF-Y激活与细胞周期相关的基因，如cyclin A、cdc25C、cdc2等，还抑制细胞色素P450-单氧化酶的表达；ATF家族与细胞因子及细胞应激响应相关；CREB、Myb对血细胞生成重要，而CREB和ATF为神经细胞成熟所必须。由此也可看出Ref-1参与生理功能的范围是十分广泛的。

    完整的大鼠胚胎组织培养中，Ref-1的免疫去除可以抑制氧还刺激诱导的AP-1 DNA结合。类似还发生在热刺激的NIH3T3、HeLa细胞、以及低氧刺激的HT-29细胞中。有一点不同的是：NIH3T3、HeLa中的基础AP-1活性似乎不受Ref-1的影响，而大鼠胚胎组织中无论是基本的还是氧化刺激的AP-1均可被Ref-1免疫去除所抑制。可能与胚胎的发育相关。

    抑癌因子p53作为转录因子可转录激活细胞周期的停滞或凋亡相关的基因。如X-射线、UV等氧化刺激可导致p53的激活，激活的p53转录激活p21，p21使得细胞停留于G1期而阻止细胞分裂，为DNA损伤修复提供时间。此外，p53可通过激活BAX和cyclin G的基因导致细胞的凋亡。p53的Cys残基结合有Zn离子，二酰胺或NEM可破坏其构象, 抑制DNA结合。现已证明，p53与p21、BAX、Cyclin G启动子元件的结合均有赖于Ref-1。在Sass-2、H1299细胞中，Ref-1和p53的共转染可明显增强相应报告基因的表达。

    Pax转录因子家族家族有九个成员，均具有paired domain，即由128个氨基酸组成的DNA结合域。Paired Domain可进一步分成PAI、RED两个亚域。Pax对发育分化重要，其中Pax8是正常甲状腺功能所必须。共转Ref-1导致Pax-5响应的B细胞专一激活蛋白和CD19的启动子、Pax-8响应的甲状腺球蛋白的启动子活性成倍提高。在Pax-5上，Ref-1调控PAI亚域的氧还状态。但RED亚域的DNA结合能力不受氧还调控，相反在还原时反而不能与DNA结合。

    PEBP2也写成PEBP2/AML，以表明它分别作为小鼠多瘤病毒增强子核心区结合因子、人急性髓样白血病相关的染色体移位失活基因所发现的历史。DNA结合域（与果蝇体节基因runt同源，称为Runt域）的Cys115和Cys124是它们的氧还敏感中心。事实上，这两个半胱氨酸残基在含Runt域的蛋白家族中高度保守，包括从海洋生物urchin、鸡到哺乳动物（但在果蝇和线虫中为丝氨酸或酪氨酸）。Ref-1可明显增强PEBP2的DNA结合活性。

    第一部分提到低氧诱导因子HIF-1α及其相似因子HLF，研究表明Ref-1对它们也有激活作用，但情况较为复杂。尽管HIF-1α与HLF有48%的同源，但氧还调控不尽相同。Ref-1还原HLF的N端促进其DNA结合，但对HIF-1α DNA结合无影响。哺乳动物细胞双杂交也证实Ref-1与HLF N端而不与HIF-1α的N端相互作用。差别可能就源于N端一个氨基酸残基的不同：HLF中是Cys，而HIF-1α是Ser。有趣的是，当把HIF1α的Ser突变为Cys,它就由氧还不敏感变为敏感。转录激活方面两者却都可以被Ref-1增强。HeLa细胞中共转染反意Ref-1，就削弱了HLF 及HIF-1α的激活能力,下降达8～25倍。HIF-1α和HLF的C端域是它们的转录激活域。在低氧条件下，可以和转录激活辅蛋白CBP（CREB结合蛋白）、SRC-1（160kDa 辅蛋白家族成员）相互作用，一起激活目的基因的转录。C端域的一个Cys-Ser突变可破坏HIF-1α或HLF与CBP的相互作用，表明存在氧还调节。酵母双杂交证实Ref-1可以增强这个相互作用，进而增强C端域的转录激活能力。说明Ref-1可能还原了低氧诱导因子C端的Cys从而增强其与CBP的作用而促进转录。因此，Ref-1通过两个独立的途径激活低氧诱导因子的转录激活能力：N端直接促进DNA结合（仅对HLF），C端间接促进转录激活。

2.6.2 激活机制的探讨

    说Ref-1对氧还敏感转录因子的激活是氧还作用的结果，事实上是一种比较含糊、笼统的说法。真正的机制还不十分清楚。p53在DTT还原作用下的确可以提高其DNA结合能力，但仍会随Ref-1的加入而进一步增强，表明不能用简单的二硫键打开还原来解释Ref-1的激活功能（Jayaraman et al., 1997）。Ref-1的晶体结构也对其Cys残基参与二硫键还原提出了质疑（Gorman et al., 1997）。可能更重要的还是Ref-1与受调控转录因子的蛋白-蛋白相互作用而导致的构象变化，这还有待以后的实验证实。

    对转录因子的氧还调控还牵涉到Trx蛋白。Ref-1对AP-1的激活有赖于Trx的入核和对Ref-1的还原；Trx也促进Ref-1对p53响应报告基因的激活，而突变无氧还活性的Trx过表达会影响Ref-1对p53的促进作用。但Trx是否能单独起到还原转录因子的作用呢？在NF-κB和PEBF2的研究中，EMSA表明Ref-1和TRX均能独立、但协同地促进DNA结合。然而在COS7细胞中及用重组蛋白的研究表明，AP-1并不是Trx的直接底物。存在从Trx到Ref-1再到转录因子的级联的可能性更大些。

2.7 Ref-1生理功能的研究

2.7.1发育

    原位杂交和免疫组化表明Ref-1的表达受到发育时程的调控。如小鼠、大鼠的脑部发育伴随着Ref-1的转录下降；在成年大鼠睾丸中的生精各个阶段，Ref-1的表达也有不同的表达谱(Tan et al., 1996; Wilson et al., 1996)。

    Xanthoudakis et al.于1996年进行了Ref-1基因的knockout研究，结果发现ref-1-/+的杂合子小鼠仍然可以无异常地发育生长，而ref-1-/-的纯合子小鼠在胚胎5.5天时就发生恶变，在着床后不久，于胚泡形成期死亡。这充分表明了Ref-1是一个早期胚胎发育所必须的蛋白。

2.7.2 对抗细胞氧化损伤

    Ref-1作为DNA损伤修复酶的功能研究由来已久，随着Ref-1基因的克隆，往往可以采用过表达、反意的手段人为改变胞内Ref-1的表达水平，而后观察细胞对细胞损伤药物的敏感性的改变。表2-3列出了部分的研究结果。

表2-3. Ref-1对抗细胞氧化损伤的研究

改变Ref-1	细胞	药物	效应	文献
过表达	E. coli xth mutants	MMS	保护	Robson et al., 1991
		H2O2	NC	Robson et al., 1991，Chen et al., 1993
		γ-射线	保护	Chen et al., 1993
	E. coli xth, nfo mutants	MMS	保护*	Hansen et al., 1998
		H2O2	保护*
	HeLa cells	MMS	保护*	Hansen, et al., 1998
		BCNU	保护*
	CHO cells	MMS	NC	Prieto-Alamo et al., 1999; Tomicic et al., 1997
		H2O2	NC	Prieto-Alamo et al., 1999; Tomicic et al., 1997
		博来霉素	NC	Prieto-Alamo et al., 1999
		Bioreductive drugs	更敏感	Prieto-Alamo et al., 1999
	C6 神经胶质瘤细胞	MMS	NC	Herring et al., 1999
		γ-射线	NC
反义核酸	人肺癌细胞	γ-射线	更敏感	Chen et al., 1994
	大鼠神经胶质瘤细胞	MMS	更敏感	Ono. et al., 1994
		H2O2	更敏感
		ACNU	NC
	HeLa cells	MMS	更敏感	Walker et al., 1994
		甲萘醌	更敏感
		H2O2	更敏感
		Paraquat	更敏感

 *： MGMT- Ref-1 嵌合蛋白.

    E．coli AP核酸内切酶的缺陷可被Ref-1所弥补，从而抵抗烷化剂甲基甲烷磺酸(MMS)及γ射线。但对H2O2的氧化损伤无保护作用，可能与Ref-1较弱的DNA 3’-二酯酶修复活性有关。在Apn1缺陷的酵母中也有类似的报道。当Ref-1和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）组成嵌合蛋白后，就可以抵抗H2O2的损伤。但在有些细胞如大鼠C6 神经胶质瘤细胞中过表达Ref-1，虽然可以使Ref-1活性上升5倍，却并不增强细胞对MMS、γ射线及H2O2的抵抗。然而反意的引入普遍会增强细胞的敏感性，反应了Ref-1对抗氧化的功能。

    另一方面，CHO细胞中Ref-1的过表达使得细胞更敏感于丝裂霉素C、泊非霉素（即甲基丝裂霉素）、道诺霉素、及aziridinyl苯醌。而过表达Ref-1的突变体则削弱对这些药的敏感性。事实上，药物敏感性可能就来自Ref-1对这一类生物还原激活药物的还原。这也正是Ref-1的又一大功能（见图2-1），在药物增敏方面有潜在的应用前景。