DNA免疫研究进展

DNA免疫研究进展

金菁

摘要
    九十年代开始，随着各种感染性疾病的DNA疫苗研究的发展，为应用分子免疫学开辟了一片新的领域。将编码保护性蛋白表位的cDNA插入含强哺乳动物启动子的载体中构建成DNA疫苗。本文中主要对DNA疫苗的免疫机理、载体及激起的全面免疫反应，和对付多种病毒、细菌、支原体、原生动物、寄生虫感染的成功应用以及在一些方面的缺陷进行了讨论。文中还介绍了由于DNA免疫使免疫反应由Th2类占优势转为Th1类占优势的特性，DNA免疫还被用来防止或抑制肿瘤的产生，以及抑制IgE抗体反应。各种接种途径及免疫方法的优势及劣势也在文中得到讨论，包括使用“基因枪”运送质粒和在注射DNA之前使肌肉损坏以提高表达的方法。另外，还对利用DNA免疫的一种新的鉴定保护表位的方法－表达文库免疫，以及DNA疫苗作为佐剂和用来激起粘膜免疫方面的应用和特性进行了介绍。由于DNA疫苗构建简便、多样，且随着该领域研究的迅速发展，DNA疫苗将会展现更多成功的应用。

前言
    传统疫苗主要有活疫苗和减毒疫苗^1，2，利用它们能够感染细胞的特性，可以激起体内广泛的免疫反应。但这类疫苗的缺陷在于感染的危险性³，疫苗制备及储存的困难^4，5，以及由病原体生物特性决定的抗原呈递的局限性⁶。随着重组DNA技术，单克隆抗体制备技术的发展，各种病毒和细菌的亚单位疫苗的研究和制备发展起来^7，8，9。单克隆抗体可以用来纯化用作疫苗的抗原，而重组DNA技术使得迅速、经济、大量地表达免疫原成为可能^7，8，10。九十年代起，一种新型的疫苗发展起来－DNA疫苗，也称为核酸疫苗，基因疫苗（在本文中采用DNA疫苗的名称）。由于它的各种特性，DNA免疫的研究日益引起学者们的关注，且得到越来越广泛的应用。

DNA免疫机理
    DNA免疫的第一步是成功地转染细胞，被吸收的质粒在强哺乳动物启动子作用下，合成mRNA，进而合成免疫原性蛋白。如果被转染的细胞是专职抗原呈递细胞（APC）（如树突状细胞），它们表达 I类及II类MHC蛋白以及共刺激分子（如B7.1和B7.2），蛋白经加工后，与I类重链和β2微球蛋白结合以I类途径呈递，或与II类α和β链结合以II类途径呈递。免疫原性的I类或II类复合物在细胞表面表达，呈递给原初T细胞，启动免疫反应。
    如果肌细胞11或其它非专职APC是cDNA的最初转染细胞类型，那么DNA免疫的第二步则是从该类细胞将目的蛋白转移到APC。目前提出两种机制：①肌细胞分泌蛋白（该假设已经得到证实）②细胞死亡后APC获取蛋白（如通过凋亡）12。
    第三步是APC呈递蛋白至II类或I类MHC途径。在II类途径中，蛋白被内吞进入胞质中的囊泡系统。囊泡中的pH值降低以激活蛋白酶降解蛋白成多肽。同时，内质网上合成II类分子，部分折叠时与Ii（非变链）结合防止抗原肽的结合。Ii指导II类分子转运通过高尔基体进入酸性内吞体，其包含有目的肽和一个胞内II类分子H2DM，后者激活Ii末端CLIP的剪切和Ii的降解。最终抗原肽结合到II类分子上，定向转运到细胞表面13。在I类途径中，蛋白的合成（如病毒蛋白）发生在细胞质中，合成的蛋白被蛋白酶体加工作用成多肽，后者通过TAP-1/TAP-2（抗原加工相关的转运体）异二聚体转运到内质网上。在内质网上，部分折叠的I类分子（重链）与钙粘连蛋白结合，之后β2微球蛋白（β2m）取代它与I类分子结合。TAP异二聚体将抗原肽转运至与I类分子结合，I类分子完成折叠，重链：多肽：β2m三聚体形成，最后该I类三聚体被转运到细胞表面。
    如果蛋白不是在胞质中合成，而是被内吞体摄入APC，那么蛋白必须进入胞质以让蛋白酶体消化其成多肽，再如上所述转运给I类分子。如果树突状细胞摄入含目的蛋白的凋亡体12或者蛋白进入内吞体或溶酶体而没被完全消化成氨基酸，那么多肽转运进入细胞质成为可能。虽然目前对该过程的机制并不清楚，但它似乎是APC发挥最佳功能所必需的，尤其是在DNA免疫后。
    虽然抗原加工过程发生在DNA免疫部位，而树突状细胞呈递抗原给原初T细胞这一关键步骤则发生在淋巴结和脾脏的T细胞区。这些区域分布着富含内皮细胞的管道，适合原初T细胞和B细胞得以离开血液进入淋巴组织。此外，该区域还含大量交错突细胞（IDC）这是一种高功能的树突状细胞14，被认为能以最具免疫原性的方式将多肽呈递给原初淋巴细胞。这些细胞表达与多肽结合的 I 类或 II 类MHC蛋白，共刺激因子B7，分泌IL-12和其它细胞因子。在这些区域内存在免疫部位具有的任何一类炎性细胞，它们对于成功地激起免疫反应起到重要作用。
DNA免疫的优缺点
    该技术是指将编码病原体抗原的质粒DNA接种入宿主体内或细胞内。这些病原体的抗原在胞内合成，产生可直接与 I 类或 II 类MHC分子结合的抗原肽以呈递抗原15，16，17。该方法没有感染的危险，并能激起机体广泛的免疫反应。与传统疫苗相比，含开放读码框和合适真核转录翻译控制信号的质粒DNA直接接种，导致体内合成构象及翻译后加工形式与天然感染情况相同的蛋白。内源蛋白的合成类似病毒的感染，可以以 I 类途径呈递外源蛋白，而专职APC摄入可溶蛋白，可以以 II 类途径呈递蛋白。因此免疫反应的两条途径都被激活18。此外，DNA免疫不会引起由活病原体感染导致的包括细胞死亡和炎症在内的组织变化。DNA免疫的危险性在于DNA整合入宿主基因组的可能性，尽管这种可能性计算下来非常低19，20。很明显，反转录病毒癌基因DNA注射入敏感宿主体内可能引起肿瘤。外源DNA可能在原癌基因或一个肿瘤抑制子基因的邻近整合以激活前者或使后者失活。而且由于DNA疫苗使用强哺乳动物启动子元件，在其控制下一定基因的表达可能引起危险，尽管计算下来这种危险发生的可能性也只有10-12到10-19。
    与传统疫苗相比，DNA疫苗的生产较简单，且DNA疫苗较蛋白疫苗、活疫苗及减毒疫苗要稳定21，22。目前，DNA在室温下的稳定性没有一个确切的标准，或许将来可以通过转染对CTL敏感的靶细胞或能与DNA疫苗诱导的抗体反应的细胞，对其稳定性作分析。
    DNA疫苗在免疫那些携带母体来源抗体的婴儿方面也很有前途。因为母体来源的抗体可能会中和微生物体并防止其复制，因而减弱活疫苗的功效，但它们不能识别核酸载体，因此可以正常合成编码蛋白并激起免疫反应。研究表明，6个月以下婴儿体内的母体来源抗体能抑制活麻疹疫苗的作用，而最佳免疫时间则是4到9个月。口服小儿麻痹症疫苗、百日咳毒素疫苗以及其它一些蛋白疫苗也存在类似情况23。当然，在面对母体来源抗体的情况下，DNA疫苗也有可能不能奏效，尤其是在体液免疫方面。如果母体来源的抗体与DNA免疫后被转染细胞释放的蛋白抗原结合，而使其不能被APC细胞摄取，则不能进入 II 类MHC途径。而含 I 类MHC反应的免疫原性肽的蛋白可能不会与母体来源的抗体作用而不影响免疫反应。此外DNA疫苗不含复制元件，较活疫苗而言，在对孕妇或无免疫应答的人群接种方面更为安全。
    最后，DNA的制备较为便宜，热稳定性好，易于进行遗传操作，这些特点使得设计出含各种病原体来源的免疫原性序列的DNA疫苗成为可能。目前已经在多种模型系统中证明了含特异抗原的DNA免疫能够成功对抗由病毒15，24～36（表一）、细菌37，38、寄生虫39～42和支原体43～46（表二）引起的感染性疾病。另外DNA免疫还可以用来治疗自身免疫、肿瘤和过敏反应47～50（表三）。各种实验证明，编码各种外源抗原的DNA免疫后，体液和细胞免疫反应均可被检测到。
表一，对抗病毒感染的DNA免疫¹¹⁷：

病毒	病毒分类	免疫基因	免疫动物
Bovine diarrhea	RNA/pesti	E2	小鼠
Cytomegalovirus (CMV)	DNA/herpes	MCMV/IEI	小鼠
Dengue	RNA/Flavi	PreM/E	小鼠
Hepatitis B	DNA	PreS1,PreS2+S	小鼠
Hepatitis C	RNA	CAP	小鼠
		HCV+HBV	小鼠
Hepatitis D	RNA	cDNA	小鼠
Herpes	DNA	gD	小鼠
		gD	牛
		gB	小鼠
		ICP-27	小鼠
Human Immunodeficiency (HIV)	RNA/lenti	gp120	小鼠
		gp160	小鼠，灵长类
		gp160+rev+gag.Pol	黑猩猩
Influenza	RNA/myxo	HA	鸡
			小鼠
			小鼠，牛，猴
		NP	小鼠
		HA+NP	雪貂
Lymphocytic choriomeningitis (LCMV)	RNA/arena	Nucleoprotein	小鼠
New Castle disease	RNA/paramyxo	F protein	鸡
Rabbit papilloma	DNA/papova	L1	兔
Rabies	RNA/rhabo	G protein	小鼠
			新生小鼠
Rota	RNA/reo	VP4, VP6, VP7	小鼠
St. Louis Encephalitis	RNA/flavi	PreM/E	小鼠

表二，对抗细菌、支原体、原生生物和寄生虫的DNA免疫¹¹⁷：

病原生物	免疫基因	免疫动物
Borrelia burgdorferi	OspA	小鼠
Clostridium tetani	Tetani toxin Frag. C.	小鼠
Leishmania major	gp63	小鼠
Mycobacteria tuberculosis	Ag 85, Ag36, Hsp65	小鼠
Mycoplasma pulmonis		小鼠
Plasmodium yoelii	CSP(circumsporozoite protein)	小鼠
Salmonella typhi	OMP(outer membrane protein)	小鼠
Schistosoma japonicum	Paramyosin
Taenia ovis(rapeworm)	45w	绵羊
Toxoplasma gondii	P30(SAG-1)	小鼠

表三，对抗肿瘤、预防过敏和诱导免疫耐受的DNA免疫¹¹⁷：

疾病类型	免疫基因	免疫动物
过敏	Plasmodium yoelii(Py) circumsoporozoite proein(CSP)	小鼠
		大鼠
免疫耐受		小鼠
肿瘤 乳腺癌 结肠癌	Carcinoembryonic antigen(CEA)	小鼠

    当前，一种最新的方法－表达文库免疫（ELI）已经被提出（此法将在后文专门介绍），并进行了动物实验，以期找到传染性生物的关键免疫原性蛋白45～66。但该方法的局限性在于，动物与人对同一抗原反应性的不同。比如，流感病毒Matrix A蛋白可以激起CTL反应，但该表位仅局限与人的HLA-A2表位，而这在小鼠中是缺乏的。因此，若想从流感病毒文库中筛选出对小鼠和人均能作用的免疫原，在ELI中就不必检测Matrix A蛋白。尽管ELI可能不会应用于人类自身，但随着该方法的不断改进和提高，将逐步克服以上缺陷，从而可以快速寻找到各种病原体的免疫原性蛋白，为预防及治疗相关疾病作出贡献。 
DNA免疫的载体
    各种因素影响着DNA免疫后基因的表达，包括使用的质粒、给药方式及器具。目前使用的质粒通常含来自人巨细胞病毒、SV40病毒及β－肌动蛋白的极早期启动子，它们可以在许多类细胞中引发高水平的基因表达52。最近对该系统的改进包括增加内含子53和有效的转运终止/加工单元54。增加或调节DNA疫苗效率的方法包括增加DNA的稳定性，增加在被注射组织中的分散性，以及共表达共刺激因子（如B-7.1和B-7.2），它们可以增加抗原的呈递或共刺激作用，或者通过共表达细胞因子免疫刺激因子（如IL-2、IL-7、IL-10、IL-12或GMCSF）增强免疫反应55, 56。另一个途径是使用双顺反子载体57，装载抗原和免疫反应增强子的基因。
DNA免疫的给药方式
    目前DNA疫苗给药方式主要有：注射溶解于盐溶液中的裸DNA，或DNA与脂类的混合物，或者以气溶胶或包被于金颗粒表面的形式，使用电场力61或高压气（如氦气）62作为推动力，直接将DNA注入表皮和真皮。其中最广泛使用的免疫方法是直接于腿部骨骼肌中注射裸DNA。免疫后，基因在注射部位附近的肌肉细胞中表达，实验发现质粒DNA和它编码的蛋白在免疫后一年多 的时间内都可以检测到63, 64。实验还发现在注射DNA之前，肌肉事先用毒素65或局部麻醉剂67处理使其损坏，可使表达抗原的肌肉细胞数增加达10倍，并增强免疫反应65, 66。目前并不清楚由此引起的免疫促进作用是在于再生的肌细胞还是在于聚集到受伤组织处的专职APC抗原表达的提高。与裸DNA相比，DNA－脂类混合物以肌肉注射形式免疫表达较低，而以静脉注射方式免疫则有较高的表达。特别是静脉注射可以导致在许多器官67，尤其是脾脏中基因的表达68。
    虽然目前为止，大部分实验采用的是肌肉注射方式，但皮肤是该技术大有希望的靶组织。因为皮肤接种操作简单，且皮肤富含抗原呈递细胞69，实验证明皮内注射DNA能诱导长期的保护效应及强抗原特异性免疫反应70。基因枪免疫较肌肉注射免疫，诱导同等水平保护效应所需DNA量要少得多71，但肌肉注射在诱导细胞免疫方面又较皮内注射优越72。由于肌肉细胞处于分化终端，而表皮细胞的迅速更替可以排除大量DNA，这在一定程度上缓解了持续表达的安全性问题。另一方面，表皮基底层细胞为干细胞，可能更容易被转化。
    当前一种新的皮肤接种DNA疫苗的方法被发展起来。将编码蛋白的DNA克隆进入一个腺病毒载体，然后直接涂擦于去毛且用NairTM处理过的小鼠腹部皮肤上。一个月后，24只小鼠中有23只产生载体上编码蛋白的抗体，并可检测到腺病毒蛋白的抗体73。最新的一个实验中甚至直接将裸DNA的PBS溶液涂擦于未经处理的小鼠皮毛上进行免疫，可以诱导质粒所编码抗原特异性的体液免疫反应，和Th2类占优势的Th细胞反应。实验还进一步证明外源基因的转入和表达依赖于正常毛囊的存在。这为DNA免疫机制及免疫方式的探索作了新的尝试。
    利用Shigella（赤贺氏细菌）能够进入上皮细胞并逃脱吞噬细胞的吞噬，可以帮助质粒直接进入胞质以很好地进行蛋白的合成和抗原呈递的加工过程。该途径已经成功地在豚鼠的结膜和鼠的鼻内模型实验中应用。实验中高度减毒的Shigella（赤贺氏细菌）以质粒pCMVβ-gal转化，感染豚鼠后，可在被感染的豚鼠角膜中检测到β－半乳糖苷酶活性，并可以在经鼻内感染的BALB/C小鼠中检测到β－半乳糖苷酶的体液及细胞免疫反应74。目前，已经提出E.coli（大肠杆菌）75，Salmonella（沙门氏菌）和Listeria（李斯特菌）76均可以用来作为质粒DNA的载体使其进入细胞质，因为这些生物不会因溶酶体的作用而被杀死。而且该系统的优点在于可以直接将抗原基因DNA运送至粘膜免疫系统。这样就可以同时以多重抗原基因进行免疫，指导 I 型与 II 型抗原肽的呈递以激起细胞毒性Th1和/或Th2类免疫反应。以细菌作为DNA疫苗或基因治疗的载体的最大优势还在于口服或粘膜用药的方便性和可行性。
    此外，有人实验将质粒DNA直接注射入小鼠的脾脏，该质粒编码人免疫球蛋白的重链，结果虽然一次接种就激起了长期的抗体反应，但发现转入的基因整合进了宿主的基因组77。
DNA免疫引起的免疫反应
    实验发现直接注射编码病毒蛋