长篇综述：细胞凋亡受体及信号传导（二）

3、线粒体在CD95诱导凋亡中的作用

     研究还显示在CD95诱导的凋亡中线粒体起了很重要的作用。首先在凋亡细胞中，Caspase引起线粒体PT（Permeability transition）孔的打开，导致线粒体的跨膜电位下降，同时细胞色素C被释放到胞质中，但是也有报道认为细胞色素C的释放不依赖PT孔。细胞色素C在胞质中可以激活Caspase－9，后者再激活Caspase－3^[27,28]。凋亡抑制蛋白家族的两个主要成员：Bcl-2，Bcl-xl都作用于线粒体从而抑制凋亡。

     Bcl-2首先是在B细胞中被发现的，目前已经发现了多种蛋白属于Bcl-2家族，Bcl-2家族分为两类，一类是抗凋亡的主要有Bcl-2、BclXl、BclW、Mcl-1。一类是促进凋亡的主要包括Bax、Bak、Bad。Bcl家族中的大多数都可以形成同源或异源二聚体，如Bax与Bcl-2可以形成异源二聚体，细胞中Bax和Bcl－2的比例就决定了细胞是否死亡的命运。Bcl－2对线粒体释放的细胞色素C的释放有抑制作用，而细胞色素C对Caspase有激活作用。Bcl－2抑制凋亡的实验中，细胞色素C都没有释放。那么Bcl－2是如何影响线粒体的呢？最近的Bcl－Xl单体的结构和功能研究发现它和可以形成离子通道的一些毒素非常相似。随后的电生理实验表明Bcl－2，Bcl-Xl都可以在人工脂膜上形成离子通道。它们可能通过调节跨膜的电化学梯度而对细胞凋亡进行调节，也可能它们是PT孔的组分，当PT孔打开时引起细胞凋亡^[29]。

     研究中发现有两种不同的凋亡信号通路细胞类型I，II。在类型I细胞中，大量的Caspase－8在DISC处被活化然后直接激活Caspase－3。这一步骤不依赖于线粒体的变化。类型II细胞中，只有很少量的Caspase－8被激活，所以凋亡需要线粒体的参与。依赖它激活大量的Caspase－3，Caspase－8，这一过程中细胞色素C起到了重要作用，它可能于Apaf-1结合，Apaf-1是与CED－4同源的人源蛋白，结合后激活Apaf-3（Caspase－9），Apaf-3激活Caspase－3。也只有在II类细胞中，Bcl-2，Bcl-xl的过量表达才能抑制凋亡。它们可以抑制线粒体释放细胞色素C，同时还可能直接与Apaf-1和Caspase－9结合来抑制它们的活化^[30,31,26]。

三、THFR1、TNFR2/TNF及信号传导

1、TNFR与TNF

     TNF受体在多种细胞中调控多种功能如：生长、分化和凋亡。TNF受体主要有两种形式的分子。它们都是I类膜蛋白。由于两个不同的配体TNFα、LT－α（lymphotoxine-α）可与两个受体结合，TNF/TNFR系统的生物功能比CD95L/CD95系统要复杂的多，同时对前者的了解也少的多。TNF在许多细胞和组织中都有表达如：巨噬细胞、单核白细胞、淋巴样细胞和成纤维细胞，在发烧、组织损伤、肿瘤坏死等生理功能中起重要作用。TNFR1在绝大多数细胞中都有表达，我们通常认为它在TNF介导的免疫反应中起主要作用，因为TNFR1被敲除的小鼠对内毒素不敏感，并且免疫系统的发育受到影响，所以TNFR1可能参与了免疫系统形成的信号调控。TNFR2与TNFR1一样分布广泛，不同之处在于它与可溶形式TNF（sTNF）亲和力较弱，可能主要被膜蛋白形式的TNF（mTNF）激活。另一个不同点在于它的胞内区没有DD，但是它可以直接与TRAF1和TRAF2结合，通过这种方式来传递信号。TNFR2结合的配体可以传递给TNFR1加强TNFR1的信号。在TNFR2缺失的大鼠体内，免疫组织发育正常，但是大鼠表现出对TNF诱导凋亡或坏死的抗性，这也说明部分凋亡信号由它介导^[8]。

2、TNF受体介导的信号传导

     同CD95一样TNFR胞内区也有一个DD区，DD区由6个α螺旋组成。如果两个蛋白都含有DD，它们可以通过DD相互结合。在结构上DD区与DED（death efector domain）和CARD（caspase recruitment domain）相关^[32]。TNF与受体的结合导致TRADD与TNFR的DD结合，TRADD本身也含有DD区。在细胞中如果过量表达TRADD，即使没有TNF诱导，细胞也会发生凋亡，同时激活NF－κB和JNK（jun kinase），这说明TRADD为下游的信号分子提供与受体复合物结合的位点^[33]，如图二：

     通过TRADD与受体复合物结合的蛋白包括RIP和FADD（Fas associated protein with death domain）。RIP的N端有一个DD区，C端是一个具有激酶活性的结构域。基因敲除实验表明RIP在TNF激活NF－κB的过程中是必需的。FADD的C端有一个DD区，N端则是DED区，它的DED区可以与caspase8前体的DED结合，这对TNFR1和CD95诱导凋亡均具有重要作用^[34]。通过这些结合TNFR1也形成如CD95的DISC复合物。然后FADD激活caspase8，再激活下游的caspase，如caspase3。

     FADD的功能在TNFR1和CD95信号通路中的作用基本相同，但是对于RIP则不同。前面我们提到RIP可以与CD95的DD区结合，但是这种结合是没有功能的。在TNFR1信号通路中，它却有重要功能。对RIP被敲除小鼠的细胞进行研究发现，TNF诱导的凋亡在这种细胞中得到了增强，同时TNF激活NF－κB被抑制。RIP具有丝氨酸苏氨酸激酶活性，它可能激活其它的激酶然后磷酸化NF－κB的抑制蛋白IκB^[31]。

     另一个参与TNFR1信号传导的DD接头蛋白是RAIDD（RIP associated ICH-1/CED-3-homologuos protein with a death domain）。除了DD区，RAIDD还含有一个CARD区，通过这一区，RAIDD与caspase2前体的CARD区结合，然后激活caspase2。体外实验表明RAIDD过量表达能诱导凋亡。但是这一信号通路有一定的不确定性，因为无论是TNF还是CD95L均不能诱导FADD或caspase8缺失的细胞发生凋亡，而在这些细胞中RAIDD和caspase2的功能是正常的，同时TNF可以诱导caspase2缺失的细胞发生凋亡，这些现象说明RAIDD，caspase2在TNFR1信号通路中可能并不重要^[35,36]。

     TRAF（TNF receptor associated factors）是指能在TNF受体家族成员之间相互作用的一种蛋白。目前已经发现的TRAF蛋白有六种，TRAF1，TRAF2，TRAF3（CRAF,LAP-1,CD40-bp）TRAF4（CART1），TRAF5和TRAF6。TRAF的C端同源性较高，参与蛋白间相互作用。TRAF2，3，5，6的N端含有一个锌指结构。除了TRAF4，TRAF可以直接或间接与受体结合，间接作用包括通过其它的TRAF相互结合，或者通过TRADD相互结合。TNFR2（p75），CD40，CD30和LTβR胞内区都含有保守的TRAF结合结构域，能够直接与TRAF蛋白直接结合。TNFR2可以与TRAF2结合，TRAF2可以与TRADD结合，通过TRADD，TNFR2与TNFR1发生相互作用，从而通过这种间接方式参与胞内信号传导^[37]。对TRAF2，3被敲除的小鼠研究表明，TRAF是TNF激活Jun/AP-1所必需的，这也说明TRAF参与了TNFR的信号通路^[38]。

     IAP（inhibitor of apoptosis protein）首先在杆状病毒中被发现，它能抑制杆状病毒引起昆虫细胞凋亡。在哺乳动物，两栖动物和酵母中都发现了它的同源蛋白。所有的IAP均有一至三个BIP（baculovirus IAP repeats）重复结构，大多数C端含有锌指结构，部分IAP如MIHC、MIHB还有CARD结构域。MIHC和MIHB可与TRAF1、2结合，参与TNFR信号通路。在培养细胞中过量表达IAP，可以抑制TNF和其它因子引起的细胞凋亡^[39,40,41]。同时，在哺乳动物细胞中，IAP还可以直接与caspase结合，抑制它们的蛋白酶活性。

     在TNF与受体结合后，NF－κB通常情况下被活化。NF－κB是很多基因的转录因子，它能调控许多转录因子、细胞因子和各种受体的转录。IAP蛋白就是由NF－κB调控转录的。在NF－κB缺失的细胞中，TNF更容易诱导凋亡，而IAP蛋白的过量表达可以保护细胞不被TNF诱导凋亡。这可能解释了NF－κB对细胞凋亡的保护作用^[41]。

    TNF同时还能激活Jun/AP-1信号途径，，这一途径是否影响细胞凋亡也不太清楚。JNK（Jun-N-terminal-kinase）/SAPK（stress activated kinase）是MAPK信号途径的一部分，它能激活AP－1的转录。在TNF激活Jun/AP-1的过程中，TRAF2参与受体与Jun/AP-1的相互作用，TRAF2如何与Jun/AP-1结合，目前不十分清楚，可能ASK－1（apoptosis stimulating kinase-1）连接了二者^[41,43]。

     在TNF诱导的细胞凋亡中，线粒体也起到了重要作用。TNF同样可以引起PT孔的开放，造成线粒体膜电位的改变和细胞色素C的释放。这在前面已经介绍，就不再赘述。