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这篇研究从根际土壤分离出 32 株金属耐受菌，经鉴定分属 12 个属。对其中差异显著的 3 株菌（Serratia marcescens X1、Mammaliicoccus sciuri X26、Rummeliibacillus pycnus X33）进行基因组分析，揭示其金属适应策略差异，为其在多领域应用提供依据。
金属耐受菌的研究背景
金属耐受菌在多种环境中广泛存在，像水、土壤、植物以及人类或动物体内都能发现它们的踪迹。这类细菌拥有多样的金属转运系统，在废水处理、植物与土壤间金属离子运输、土壤 pH 调节和污染土壤修复等领域发挥着重要作用。
金属离子对生物体生存至关重要，是细胞代谢过程中的关键参与者，但过量的金属离子会对生物体产生严重危害。微生物为了在不同金属浓度的环境中生存，进化出了多种策略来维持细胞内金属离子的平衡（homeostasis），其中金属转运系统和金属结合蛋白起着关键作用。在细菌中，金属转运系统丰富多样，包括 ATP 结合盒（ABC）转运体、双组分系统、P 型 ATP 酶、同向转运体和反向转运体等。
金属耐受菌的分离与鉴定
研究人员从中国广东广州香蕉和甘蔗根际采集土壤样本，将土壤样本稀释后，涂布在添加了 CuSO4、FeSO4或 MnSO4·4H2O（浓度均为 200mg/L）的改良 LB 琼脂平板上进行培养。经过筛选，共获得 32 株金属耐受菌，通过 16S 核糖体 RNA（rRNA）基因序列分析，确定它们隶属于 12 个属，其中包括Pseudomonas（8 株）、Cupriavidus（5 株）、Enterobacter（4 株）等。
在这 32 株菌中，选取了 16 株具有不同菌落形态且至少耐受两种金属的菌株进行深入研究。利用 16S rRNA 基因序列，通过邻接法构建系统发育树，对这 16 株菌进行分子鉴定。结果显示，菌株 X1 与Serratia marcescens C3 的 16S rRNA 基因序列相似度达 99.72%，因此被鉴定为S. marcescens；菌株 X3 与Lelliottia jeotgali N1 相似度为 99.65%，鉴定为L. jeotgali ；以此类推，确定了其他菌株的分类地位。
金属耐受菌的最大耐受浓度测定
采用点板法测定 16 株菌对铜（Cu）、铁（Fe）、锰（Mn）的最大耐受浓度（MTC）。结果表明，不同菌株对金属的耐受能力差异显著。对于铜，S. marcescens X1 和E. cloacae X6 的 MTC 最高，达到 1000mg/L，L. jeotgali X3 和A. hermannii X5 为 900mg/L，而M. sciuri X26 的耐受能力较弱。在铁方面，S. marcescens X1、C. gleum X4 和R. pycnus X33 的 MTC 均为 1000mg/L，其他一些菌株也有较高的耐受浓度。所有菌株对 MnSO4·4H2O 的耐受能力普遍较强，除了R. pycnus X33 的 MTC 为 400mg/L 外，其余菌株大多能在 2000mg/L 的浓度下生长。综合来看，S. marcescens X1 对 Cu、Fe、Mn 的耐受能力最强，M. sciuri X26 对 Mn 的耐受能力强但对 Cu 较弱，R. pycnus X33 对 Fe 耐受能力强对 Mn 较弱 ，这三株菌与其他菌株差异明显，因此被选择进行后续更深入的研究。
金属对细菌生长的影响
为了探究金属对细菌生长的影响，研究人员选取了耐受能力差异显著的 X1、X26 和 X33 这三株菌进行实验。将培养过夜的菌液转接至添加了不同金属（Cu、Fe、Mn）的 LB 肉汤中，在 30°C、150rpm 条件下振荡培养 2 天，通过测定 600nm 处的吸光度（OD600）绘制生长曲线。
实验结果显示，对于S. marcescens X1，在 500mg/L 的 CuSO4、500mg/L 的 FeSO4和 1000mg/L 的 MnSO4·4H2O 条件下，其生长曲线与未添加金属的对照组无显著差异，30 小时后 OD600达到约 1.9，表明中等浓度的这三种金属对其生长影响不明显。M. sciuri X26 由于对铜耐受性差，未进行铜对其生长影响的实验。在 300mg/L 的 FeSO4和 1000mg/L 的 MnSO4·4H2O 条件下，30 小时后其 OD600分别为 3.34 和 2.81，与对照组（OD600=3.41）相比，说明中等浓度的铁对其生长有轻微抑制作用，而中等浓度的锰对其生长有显著抑制作用。R. pycnus X33 在 500mg/L 的 FeSO4条件下生长情况与未添加金属时相近，30 小时后 OD600分别为 1.48 和 1.55，但在 300mg/L 的 CuSO4和 1000mg/L 的 MnSO4·4H2O 条件下，生长速率明显降低，30 小时后 OD600分别为 0.76 和 1.04。总体而言，S. marcescens X1 的金属耐受能力最强，R. pycnus X33 次之，M. sciuri X26 最弱；并且铜对这些菌株的毒性最强，其次是锰，铁的毒性相对较弱。
三株金属耐受菌的基因组特征
对S. marcescens X1、M. sciuri X26 和R. pycnus X33 进行基因组测序、组装和注释分析。S. marcescens X1 的完整基因组为一个 4,962,287bp 的环状染色体，G+C 含量为 59.82%，预测共有 4,542 个基因，包括 92 个转运 RNA（tRNA）基因和 22 个核糖体 RNA（rRNA）基因。与其他S. marcescens菌株相比，其基因组较小。M. sciuri X26 的基因组大小为 3,117,130bp，G+C 含量为 32.56% ，由一个 2,982,601bp 的环状染色体和两个质粒组成，共有 3,085 个基因，包含 58 个 tRNA 基因和 19 个 rRNA 基因，与M. sciuri IMDO-S72 相比，基因组较大且基因数量更多。R. pycnus X33 的基因组是一个 4,346,358bp 的完整环状染色体，GC 含量为 34.97%，大于R. pycnus DSM 15030，预测有 4,105 个基因，其中 122 个是 tRNA 基因，39 个是 rRNA 基因。通过多个数据库对这三株菌的编码序列（CDSs）进行功能注释，为后续研究它们的金属适应策略奠定了基础。
三株金属耐受菌的金属适应策略
为了深入了解这三株菌的金属适应策略，研究人员对其基因组中与金属耐受相关的基因进行了分析。在铜（Cu）稳态方面，S. marcescens X1 基因组中有多个参与铜解毒和转运的基因，如多铜氧化酶（CueO）、周质螯合剂（PcoC 和 PcoD）、MerR 家族转录调节因子（CueR）、CusS/CusR 双组分系统、高亲和力铜伴侣蛋白（CopZ）以及铜稳态蛋白（CutC 和 CutF）等，这些基因协同作用使其对铜具有较高的耐受性。M. sciuri X26 虽然有 CopZ 和 CutC，但缺乏铜感应系统，这可能是其在有外源铜存在时表现出条件致死性的原因。R. pycnus X33 的铜耐受系统相对较弱，仅含有两个铜伴侣蛋白（CopZ 和 NosL）和一个铜处理系统通透酶蛋白（NosY），其铜耐受能力（MTC 为 400mg/L）低于S. marcescens X1（MTC 为 1000mg/L）。值得注意的是，铜抗性基因（如cusSR和pcoCD）仅在S. marcescens X1 中发现，这些基因所在的铜稳态和银抗性岛（CHASRI）可能通过水平基因转移（HGT）在Enterobacteriaceae中传播。
在铁（Fe）摄取方面，S. marcescens X1 拥有众多参与铁摄取途径的基因，如铁羟基胺摄取（Fhu）系统、元素铁（II/III）（Efe）复合物、AfuABC 系统、亚铁离子转运（Feo）系统和Salmonella铁转运蛋白（Sit）等，此外还有多种铁硫蛋白参与铁稳态和细胞过程，这使得它对铁具有高耐受性（MTC 为 1000mg/L），且中等浓度的铁（500mg/L 的 FeSO4）对其生长影响不大。R. pycnus X33 虽然也有 1000mg/L 的铁 MTC，但由于缺乏部分铁摄取系统（如 AfuABC 系统和 SitABCD 转运体）和铁硫蛋白（ErpA、FrdB 和 FdoH），在 500mg/L FeSO4条件下生长明显下降。M. sciuri X26 主要通过 FhuBCD 系统和 EfeUO 复合物吸收铁，其铁耐受能力相对较弱。
对于锰（Mn）的耐受，S. marcescens X1 拥有两种锰摄取系统，即 H+依赖的 Mn2+转运体（MntH）和 ABC 转运体（SitABCD），且均受 MntR 调控，这使其对锰有较高的耐受性（MTC 为 2000mg/L）。M. sciuri X26 含有 MntH 和 ABC 转运体 MntABC 的同源物，但由于缺乏 MntR，其锰耐受能力可能受到影响，在 1000mg/L MnSO4·4H2O 条件下生长下降。R. pycnus X33 仅有一种锰转运体（MntH 同源物），是三株菌中锰耐受能力最低的。
此外，在其他金属的运输和稳态方面，三株菌也存在差异。在锌（Zn）运输方面，三株菌都含有znuABC及其调节基因zurR，但zip基因仅在M. sciuri X26 和R. pycnus X33 中存在；在锌外排方面，S. marcescens X1 拥有更多相关基因，而M. sciuri X26 和R. pycnus X33 相对较少，但它们还含有一些参与锌稳态和生理过程的独特基因，可能使其在抵抗锌方面具有一定优势。在镁（Mg）运输方面，S. marcescens X1 可能通过 PhoP/PhoQ 双组分系统摄取镁，M. sciuri X26 借助 MgtE 转运体，R. pycnus X33 则有 CorA、MgtA、MgtB 和 MgtE 四种转运体参与。在钙（Ca）运输方面，R. pycnus X33 含有参与钙内流的电压依赖性钙通道（VDCC）同源物，S. marcescens X1 含有负责钙外排的 ChaA 同源物。在钾（K）和钠（Na）运输方面，三株菌的相关系统也有所不同，S. marcescens X1 拥有更多的钾离子摄取和外排系统，M. sciuri X26 和R. pycnus X33 则相对较少；在钠离子运输方面，S. marcescens X1 和M. sciuri X26 拥有更多的摄取和外排系统来维持细胞内钠稳态，R. pycnus X33 的相关系统较少。
研究总结与展望
本研究从根际土壤中筛选出 32 株金属耐受菌，鉴定并分类到 12 个属。通过对最大耐受浓度的测定和金属对菌株生长影响的研究，发现S. marcescens X1、M. sciuri X26 和R. pycnus X33 在对 Cu、Fe、Mn 的耐受能力上与其他菌株存在显著差异。基因组分析揭示了这三株菌在金属适应策略上的不同，S. marcescens X1 具备适应高浓度多种金属的基因，M. sciuri X26 在锰和锌稳态方面有独特基因但缺乏铜和钙运输相关基因，R. pycnus X33 富含铁、锌和镁运输系统但铜和锰运输系统较弱。基于这些发现，S. marcescens X1 有望作为生物吸附剂或生物材料去除废水中和污染土壤中的 Cu、Fe、Mn；M. sciuri X26 可用于处理含高浓度 Mn 和 Zn 的环境；R. pycnus X33 可用于从环境中积累 Fe、Zn 和 Mg。联合使用这三株菌可能作为高效的植物生长调节剂，促进植物与土壤间金属运输和调节土壤 pH，S. marcescens X1 还可能在盐污染土壤修复中发挥作用。后续研究将进一步探究污染土壤中微生物群落的金属耐受性和系统发育，更全面地了解微生物应对金属胁迫的策略，为金属耐受菌在更多领域的应用提供更坚实的理论基础。
