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在癌症治疗中，ATR 抑制剂（ATRi）的临床应用面临诸多问题，如细胞对其敏感性机制不明。研究人员开展了关于 ATR 抑制引发复制灾难机制的研究。结果发现 APOBEC3B（A3B）是关键酶，引发一系列反应导致 PARP1 过度激活。这为预测癌症治疗效果提供潜在生物标志物，意义重大。
在生命的微观世界里，DNA 的复制就像一场精密的舞蹈，每个环节都至关重要。然而，在癌症治疗的战场上，这一过程却成为了研究人员关注的焦点。目前，许多 ATR 抑制剂（ATRi）正处于临床试验阶段，它们有望成为攻克癌症的有力武器。但问题也接踵而至，为何细胞对 ATRi 的敏感性存在差异？为何 PARP 抑制剂（PARPi）与 ATRi 联合使用时能高效杀死癌细胞？这些谜团亟待解开。
为了探寻答案，研究人员开启了一场探索之旅。他们聚焦于 ATR 抑制引发的一系列细胞反应，深入研究其中的分子机制。最终，他们的研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为癌症治疗带来了新的曙光。
研究人员运用了多种关键技术方法。通过 CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建相关基因敲除（KO）细胞系，如 UNG2、APE1、A3B 等基因敲除细胞系，精准探究基因功能；利用免疫荧光和 Western blotting 技术检测蛋白质表达、修饰水平及细胞定位，直观呈现细胞内分子变化；借助 DNA 纤维、TUNEL、Comet 等实验评估 DNA 损伤情况，为研究提供关键数据支撑 。
研究结果如下：
- ATR 抑制诱导 PARP1 在 DNA 复制过程中过度激活：研究人员用 ATRi（BAY-1895344）处理细胞，并与其他基因毒性应激处理对比，发现 ATRi 处理的细胞中 MAR/PARylation 水平显著升高，且主要发生在 S 期细胞，这表明 ATR 抑制会引发独特的细胞反应，导致 PARP1 过度激活。
- PARP1 过度激活招募 XRCC1 至复制叉：ATR 抑制后，PARP1 形成核焦点并与 RPA、RPA-pS4/8 和 PCNA 共定位，同时招募 XRCC1 至复制叉。XRCC1 的招募依赖 PARP1 的 MAR/PARylation 活性，敲低 XRCC1 会增加 PARP1 激活和捕获，以及 DNA 双链断裂（DSB）水平，说明 PARP1 过度激活对招募修复因子至关重要。
- ATR 通过限制起点激发抑制 PARP1 过度激活：ATRi 会使 CDK1/2 活性上调，增加起点激发，导致 PARP1 过度激活。用 CDK1/2 抑制剂处理可抑制 PARP1 的 MAR/PARylation 和捕获，且 RPA 的保护作用缺失会增强 PARP1 激活，表明未受保护的单链 DNA（ssDNA）会引发 PARP1 过度激活。
- APOBEC3B 触发复制叉处 PARP1 过度激活：敲低或敲除 A3B 后，ATRi 或 Chk1i 处理的细胞中 PARP1 的 MAR/PARylation 和捕获完全消失，A3B 的催化活性是 PARP1 激活所必需的，且 A3B 诱导的 PARP1 过度激活是对 ATRi 处理的特异性反应。
- APOBEC3B 导致 ATR 抑制时复制叉崩溃：A3B 敲除不影响 ATRi 处理后 RPA 水平升高，但抑制 γH2AX 激活，减少 TUNEL 阳性细胞和彗星尾矩，说明 A3B 驱动复制叉崩溃和 DSB 形成，同时 A3B 介导的 PARP1 激活对 XRCC1 招募至关重要。
- 内源性 APOBEC3B 不会在持续复制叉处促进 ssDNA 缺口形成：通过 DNA 纤维实验发现，内源性 A3B 在 U2OS 细胞中不诱导大量 ssDNA 缺口，且 PrimPol 生成的 ssDNA 缺口对 ATRi 处理后的 PARP1 过度激活并非必需。
- APOBEC3B 使细胞对 ATR 和 PARP 抑制剂高度敏感：A3B 敲除的 U2OS 细胞对 ATRi 或 Chk1i 具有抗性，PARPi 与 ATRi 联合使用可协同增强细胞死亡，且 A3B 缺失会降低细胞对联合治疗的敏感性，表明 A3B 诱导的 DNA 断裂使细胞对 ATRi 敏感，与 PARPi 联合产生合成致死效应。
- APE1 切割无碱基位点触发 PARP1 过度激活：敲除 UNG2 或 APE1 会消除 ATRi 处理后 PARP1 的 MAR/PARylation 和捕获，抑制 DNA-PKcs 磷酸化、γH2AX 水平、TUNEL 阳性细胞和彗星尾矩，说明 UNG2 和 APE1 在 A3B 介导的反应中起关键作用，促进复制叉崩溃、PARP1 激活和修复因子招募。
- 无论无碱基位点如何产生，APE1 诱导的 PARP1 过度激活都会发生：用 MNNG、MMS、H2O2处理细胞发现，APE1 敲除会消除 PARP1 激活，不同 DNA 损伤由不同糖基化酶产生无碱基位点，再由 APE1 切割导致 PARP1 过度激活，表明 APE1 切割无碱基位点是促进 PARP1 过度激活的关键步骤。
研究结论表明，ATR 抑制时，A3B 攻击未受保护的 ssDNA，引发一系列反应，包括 UNG2 产生无碱基位点、APE1 切割，最终导致复制叉崩溃、DSB 形成、PARP1 过度激活和修复因子招募。这解释了 RPA 的保护作用及 ATRi 与 PARPi 联合治疗的协同效应，A3B 表达水平有望成为预测患者肿瘤对这些疗法敏感性的生物标志物。该研究为深入理解癌症发生发展机制提供理论依据，为癌症治疗策略的优化指明方向，有助于开发更精准有效的癌症治疗方案，具有重要的科学意义和临床应用价值。
