加拿大卡尔加里弓河微塑料中九株分离菌全基因组序列：洞悉淡水微塑料微生物组与塑料降解潜能

为探究淡水微塑料微生物组及其塑料降解潜能，研究人员从加拿大阿尔伯塔省卡尔加里弓河的水和沉积物微塑料中分离出九株细菌菌株，测定其全基因组序列。这一成果有助于深入了解淡水微塑料微生物生态及塑料降解机制。

　　微塑料是全球环境中普遍存在的污染物，作为微生物群落的宿主，其微生物群落与周围环境不同。研究人员从加拿大第四大城市卡尔加里的弓河（与诺斯溪和肘河交汇处下游）的微塑料中分离出细菌。从水（40 升）和沉积物样本（0.5 千克）中分别通过 20μm 过滤或 CaCl₂密度分离（1.4 千克 / 升）分离微塑料，随后进行尼罗红染色。微塑料用 1×PBS 缓冲液冲洗两次，在室温（22°C）下接种于液体 LB 或 R2A 培养基中。当可见生长（2 - 3 天）后，将液体培养物稀释 10^?4，涂布在相应的固体培养基（含 1.5% 琼脂的 LB 或 R2A 培养基，室温）上，然后划线 4 - 5 轮以实现分离。从每个分离株中选取一个菌落，在相应的液体培养基中培养 48 小时，使用 Lucigen MasterPure Complete DNA & RNA Purification Kit（Mandel Scientific）按照革兰氏阳性菌的制造商提供的方案提取高分子量 DNA。DNA（无需剪切或大小选择）在 R10.4.1 Nanopore MinION 流动池上使用 Native Barcoding Kit 24（SQK - NBD114.24，Oxford Nanopore）进行测序，并使用 Dorado（v7.3.11，e8.2_400bps_sup@v5.0.0 模型）进行碱基识别。通过 Porechop ABI（v0.50，ABI 模式）和 Chopper（v0.80）分别去除纳米孔接头等技术序列和低质量读数（≤1,000bp，Q≤10）。使用 Flye（v2.9.3；nano - hq 模式）进行基因组组装，并用 Medaka（v1.11.3）进行优化。使用 CheckM2（v1.0.1）计算基因组完整性和污染程度。使用 OrthoANIu 去除≥99.90% ANI 的重复基因组，使用 NCBI 原核基因组注释管道（PGAP，版本 6.7）进行注释，并使用 CRISPR - CasFinder（亚型聚类模型）识别 CRISPR 区域。使用 GTDB - Tk（v2.4.0，220 版本数据库）进行分类学鉴定。由 Flye 组装器确定的九个分离株基因组具有完全环化的染色体，大小范围从 3,939,831 到 7,333,835 碱基对，编码 3,610 到 6,553 个编码序列（CDS）和 72 到 118 个 tRNA。四个基因组中存在染色体外元件（ECEs），RS8 基因组包含六个 ECEs。在分离株中，赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus）、类芽孢杆菌（Peribacillus）和芽孢杆菌属（Paenibacillus）是革兰氏阳性菌，而假单胞菌属（Pseudomonas）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter）是革兰氏阴性菌。由于这些细菌是从微塑料中分离出来的，研究人员使用 BLAST 在 PlasticDB 和塑料微生物降解数据库中搜索其基因组中的塑料降解基因。四个基因组发现了塑料降解基因（同一性 > 80%）。分离株 LW8 和 RW9 具有聚羟基脂肪酸酯（PHA）解聚酶基因，可降解聚（3 - 羟基丁酸酯 - 共 - 3 - 羟基戊酸酯）、聚己内酯、聚醚砜、聚羟基脂肪酸酯和聚乳酸。RW9 还具有聚羟基丁酸酯（PHB）解聚酶基因，参与聚羟基丁酸酯的生物降解。RS7 和 RW6 分别含有聚氨酯和邻苯二甲酸酯生物降解的基因。一些塑料是烃衍生物，可以通过烃降解途径进行降解。因此，研究人员使用 CANT - HYD 搜索基因组中的烃代谢标记。LW8 和 RW6 含有长链烷烃单加氧酶（LadA），后者还含有另外两个烷烃代谢基因（AlkB 和 AlmA）。