糖皮质激素调控 Srsf1 表达诱导成骨细胞凋亡机制及潜在防治靶点探索

《Communications Biology》：Glucocorticoids regulate the expression of Srsf1 through Hdac4/Foxc1 axis to induce apoptosis of osteoblasts

为探究糖皮质激素（GC）诱导成骨细胞（OB）凋亡机制，以防治 GC 诱导的骨质疏松和骨坏死，研究人员开展相关研究。结果发现 GC 通过 Hdac4/Foxc1 轴下调 Srsf1 表达，Srsf1 调节 Bmf 可变剪接影响 OB 凋亡。该研究为相关疾病防治提供新靶点。

　　在骨骼健康领域，长期且大剂量使用糖皮质激素（Glucocorticoid，GC）会引发诸多问题。它就像一个捣乱分子，打破了骨代谢的平衡，让成骨细胞（Osteoblast，OB）大量凋亡，进而导致 GC 诱导的骨质疏松和骨坏死。这不仅给患者带来身体上的痛苦，还严重影响生活质量。目前，虽然知道 GC 对骨骼有不良影响，但对于 GC 诱导 OB 凋亡的具体机制，尤其是在基因调控层面，还存在很多未知。为了解开这些谜团，探寻防治 GC 诱导的骨质疏松和骨坏死的新方法，贵州医科大学附属医院等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》杂志上，为该领域带来了新的曙光。

研究人员在此次研究中，主要运用了以下几种关键技术方法：一是 RNA 测序（RNA-Seq）技术，对 GC 处理的 OB 进行检测，筛选出差异表达基因；二是利用实时定量聚合酶链反应（qPCR），验证 RNA-Seq 基因表达谱中相关基因的表达情况；三是通过染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR 技术，确定转录因子与基因启动子区域的结合位点；四是借助慢病毒感染技术，实现基因的过表达或敲低，以探究基因功能。

下面来看具体的研究结果：

• GC 诱导 OB 凋亡：研究人员将 MC3T3-E1 细胞在成骨诱导培养基中培养，发现其能从成骨前体细胞逐渐分化为成熟的 OB。接着，用不同浓度的 GC 处理 OB，结果显示，0.4mg/mL 的 GC 可显著抑制 OB 的成骨活性，诱导其凋亡，此时 OB 中促凋亡蛋白表达上调，抗凋亡蛋白表达下调。所以，0.4mg/mL 的 GC 成为后续实验建立 GC 诱导 OB 凋亡模型的理想浓度。
• Srsf1 参与 GC 诱导的 OB 凋亡：对 0.4mg/mL GC 处理的 OB 进行 RNA 测序，结合 GO 和 KEGG 富集通路分析，发现多个与凋亡和 RNA 剪接相关的基因变化，其中丝氨酸 / 精氨酸丰富的剪接因子 1（Serine/arginine-rich splicing factor 1，Srsf1）在 RNA 剪接相关基因中表达变化最为显著。qPCR 和蛋白质免疫印迹（Western blot）分析进一步验证，Srsf1 在 GC 处理的 OB 中表达下调，且与 OB 凋亡率呈负相关，这表明 Srsf1 参与调控 GC 诱导的 OB 凋亡，但具体作用还不清楚。
• Srsf1 在 GC 诱导的 OB 凋亡中的作用：通过慢病毒转染技术，使 OB 过表达 Srsf1，结果发现过表达组 OB 的凋亡率明显降低，促凋亡蛋白表达减少，抗凋亡蛋白表达增加；相反，敲低 Srsf1 后，OB 凋亡率显著上升，促凋亡蛋白表达增多，抗凋亡蛋白表达减少。由此可见，Srsf1 过表达抑制 GC 诱导的 OB 凋亡，而敲低则促进凋亡。
• SRSF1 调节 Bmf 前体 mRNA 的可变剪接并参与 GC 诱导的 OB 凋亡：利用 catRAPID 数据库预测，发现 SRSF1 可能与 Bmf RNA 结合。RIP 实验和 RNA pull-down 实验证实了两者的结合关系。qPCR 检测发现，GC 处理后，Bmf 的 V2 和 V3 变体表达发生变化，且 SRSF1 与 Bmf V2 和 V3 的表达呈负相关。敲低 Bmf 可抑制 GC 诱导的 OB 凋亡，在 Bmf 敲低的 OB 中再次敲低 Srsf1，对 OB 凋亡无明显影响，这说明 SRSF1 通过调节 Bmf 的可变剪接影响 GC 诱导的 OB 凋亡，其中 Bmf V2 是凋亡的主要调节因子。
• FOXC1 通过结合 Srsf1 启动子调节 Srsf1 表达：研究人员猜测 GC 对 Srsf1 表达的调控可能与转录因子有关，通过数据库查询，发现转录激活因子叉头框 C1（Forkhead box C1，FOXC1）可结合到 Srsf1 启动子区域。实验表明，GC 处理后，OB 中 Foxc1 表达下调，且 FOXC1 能结合到 Srsf1 启动子的多个位点。过表达 Foxc1 可抵抗 GC 对 Srsf1 表达的下调作用，敲低 Foxc1 则进一步促进 Srsf1 表达下调，这表明 GC 通过抑制 FOXC1 表达来下调 Srsf1。
• HDAC4 通过降低 Foxc1 启动子区域 H3K9ac 和 H3K27ac 水平抑制 Foxc1 表达：研究发现，组蛋白去乙酰化酶 4/5（Hdac4/5）抑制剂 LMK-235 可上调 Foxc1 表达。进一步研究表明，GC 处理后，OB 中 Hdac4 表达上调，敲低 Hdac4 可增加 Foxc1 启动子区域的组蛋白 H3 赖氨酸 9 乙酰化（H3K9ac）和 H3K27ac 水平，逆转 Foxc1 表达下调，降低 OB 凋亡率；而过表达 Hdac4 则相反。这说明 GC 通过上调 HDAC4 表达，降低 Foxc1 启动子区域 H3K9ac 和 H3K27ac 水平，抑制 Foxc1 表达。

综合上述研究，研究人员得出结论：GC 通过 Hdac4/Foxc1 轴下调 Srsf1 表达，SRSF1 结合到 Bmf 前体 mRNA 的 7807 - 8006 核苷酸位点，调节 Bmf 的可变剪接，影响 OB 凋亡。Srsf1 及其调控机制为 GC 诱导的骨质疏松和骨坏死的防治提供了新的潜在靶点。

在讨论部分，研究人员指出，该研究首次揭示了 Srsf1 不仅通过调节 Mcl-1、Bcl-X 和 caspase-9 等凋亡相关基因的表达，还通过调节 Bmf 的可变剪接影响 GC 诱导的 OB 凋亡。然而，研究也存在一些不足，比如 SRSF1 调节 Bmf 可变剪接的详细分子机制尚未明确，HDAC4 在 GC 诱导的 OB 凋亡中是否调节肌细胞增强因子 2（MEF2）表达也有待进一步探索。但总体而言，这项研究为深入理解 GC 诱导的骨骼疾病发病机制奠定了基础，为后续开发新的治疗策略提供了重要依据，有望在未来改善患者的治疗效果，减轻病痛。