铜绿假单胞菌临床呼吸道分离株对噬菌体鸡尾酒产生抗性的基因组变异：洞察噬菌体疗法新方向

本文聚焦铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），研究其临床呼吸道分离株对噬菌体鸡尾酒产生抗性时的基因组变化。通过实验发现多种基因变异，涉及噬菌体受体、毒力因子等。这些发现对噬菌体疗法及抗菌治疗意义重大，为攻克耐药菌感染带来新希望。

　　### 引言
铜绿假单胞菌是一种需氧革兰氏阴性菌，作为机会致病菌，广泛存在于环境中，可引发多种严重感染，在囊性纤维化（CF）患者的呼吸道感染中尤为关键，常导致病情恶化，且治疗因耐药问题而困难重重。噬菌体疗法作为抗生素替代方案备受关注，其利用烈性噬菌体感染并裂解细菌，但治疗中细菌易产生噬菌体不敏感突变体（BIMs），阻碍噬菌体疗法应用。本研究旨在探究铜绿假单胞菌临床分离株对噬菌体产生抗性后的基因组变异，采用体外生物膜模型进行研究。

材料和方法

1. 细菌菌株：选用两株临床铜绿假单胞菌菌株（Ned 5 和 USA 2），分别来自 CF 患者（Ned 5）和非 CF 患者的呼吸道，以及实验室参考菌株 ATCC 15692（PAO1）。这些菌株对噬菌体鸡尾酒（CT - PA）高度敏感，均保存在 25% 甘油营养肉汤中，于 - 80°C 储存，在 1.5% 营养琼脂或营养肉汤中 37°C 培养。
2. 噬菌体鸡尾酒：由 AmpliPhi Biosciences 提供四种抗铜绿假单胞菌噬菌体（Pa193、Pa204、Pa222 和 Pa223），分别为两种肌尾噬菌体（Pa193 和 Pa204）和两种短尾噬菌体（Pa222 和 Pa223），均为严格裂解性噬菌体。使用前，通过软琼脂覆盖小滴法滴定浓度，混合制成浓度为 1×10⁸ PFU/mL 的 CT - PA。
3. BIMs 的产生：在 96 孔板中培养各菌株生物膜 7 天，之后每 24 小时分别用 CT - PA 或 PBS + Mg 处理 7 天。处理结束后，从 CT - PA 处理组和 PBS + Mg 处理组的孔中取菌，分别在含或不含噬菌体的营养琼脂平板上划线培养，过夜后对生长无噬菌斑的菌株进行亚培养，并通过点测试验确认对 CT - PA 的敏感性或抗性。
4. 细菌 DNA 提取和全基因组测序：提取细菌基因组 DNA 并进行纯化，用 NanoDrop 2000 分光光度计、凝胶电泳和 Qubit 3 荧光计评估质量和浓度。分别在两个外部实验室用 MiSeq 和 NextSeq 平台进行短读长测序，用 Oxford Nanopore MinION mk1c 进行长读长测序。
5. 基因组组装：采用长读长优先的方法，使用 Trycycler 进行基因组组装。对读段进行子采样、组装、聚类，获取染色体共识序列，并用长读长和短读长数据进行多次抛光，最后用定制程序重定向染色体起始位置。
6. 变异检测和注释：创建定制流程，用 Snakemake 进行变异检测和注释。使用多种工具对基因组进行注释、分型，检测抗菌耐药基因、毒力基因和前噬菌体相关变异，手动筛选结构变异和核苷酸变异，并用 IGV 基因组浏览器和 Clinker 制作基因组图。
7. 前噬菌体诱导检测：使用定制版 hafeZ 检测 Ned 5 中的前噬菌体诱导，通过比对确定诱导前噬菌体与已知噬菌体的关系。
8. amiB 蛋白结构可视化：从 Alphafold 数据库下载预测的 amiB 蛋白结构，用 ChimeraX v1.7.1 进行可视化。
9. 抗生素最低抑菌浓度（MIC）测定：采用微量稀释法，按照临床和实验室标准协会（CLSI）方法测定不同抗生素对浮游菌的 MIC。
10. 抗生素最低生物膜根除浓度（MBEC）测定：按文献方法测定抗生素对生物膜的 MBEC，通过刃天青测定法评估生物膜活力。

结果

1. BIMs 的产生和噬菌体敏感性测试：从所有 CT - PA 处理的生物膜平板中分离出多个 BIMs，PAO1 的对照平板也分离出 1 个 BIM。选取各菌株的 1 个 BIM 进行全基因组测序，测序结果显示所有 BIM 对 CT - PA 耐药，对照菌株敏感。
2. 全基因组测序和基因组组装：所有分离株均完成环状染色体组装，平均长读长覆盖度为 13 - 27 倍，基因组长度在 6,216,926 bp 至 6,301,445 bp 之间。
3. 变异检测和注释
   • PAO1：PAO1 的 BIM 与对照相比，有 42,846 bp 的大片段缺失，对应可能的前噬菌体区域，还有 7 个小核苷酸变异（SNVs），其中 3 个在编码序列内，包括 rfaB 基因的小缺失，该基因参与脂多糖合成。
   • Ned 5：Ned 5 的 BIM 存在 11,426 bp 的串联重复，包含编码 TonB 依赖受体 FepA 的基因，还有前噬菌体诱导现象，携带 BstA 蛋白基因，同时检测到 82 个 SNVs，19 个在编码序列内，包括 rfaB 基因的小缺失。
   • USA 2：USA 2 的 BIM 无结构变异，但有 4 个 SNVs，其中 1 个在 amiB 基因编码序列内，导致氨基酸改变，结构分析显示该突变发生在 β - 发夹基序内。
   
   
4. 抗生素最低抑菌浓度（MIC）：各菌株的噬菌体处理组和对照组在抗生素敏感性上存在差异。PAO1 的噬菌体处理株对四环素、氯霉素和美罗培南敏感性增加；Ned 5 的噬菌体处理株对氯霉素和环丙沙星敏感性增加；USA 2 的噬菌体处理株对美罗培南敏感性增加，但对亚胺培南敏感性降低。
5. 抗生素最低生物膜根除浓度（MBEC）：PAO1 的噬菌体处理株和对照组对多数抗生素的 MBEC 较亲本株增加；Ned 5 的噬菌体处理株氯霉素 MBEC 降低；USA 2 的对照组四环素和氯霉素 MBEC 降低。

讨论

本研究通过 7 天的噬菌体鸡尾酒处理，使铜绿假单胞菌生物膜产生 BIMs，并鉴定出多种基因组变异。不同菌株变异不同，可能是噬菌体与宿主菌株复杂相互作用的结果。

1. TonB 依赖受体变异：Ned 5 的 BIM 中，TonB 依赖受体 FepA 基因串联重复，可能作为非功能性或 “诱饵” 噬菌体受体，阻碍噬菌体遗传物质进入细菌，但需进一步研究验证。
2. 前噬菌体相关变异：PAO1 的 BIM 存在前噬菌体缺失，其意义不明，可能与降低代谢负担等有关；Ned 5 的 BIM 前噬菌体诱导产生 BstA 蛋白，介导群体对噬菌体鸡尾酒的抗性。
3. 脂多糖相关变异：PAO1 和 Ned 5 的 BIM 中，rfaB 基因及其他脂多糖合成相关基因变异，可能改变脂多糖结构，使细菌对使用脂多糖为受体的噬菌体产生抗性。
4. 其他变异与抗生素敏感性：Ned 5 的 BIM 中，BaeS 和 opmE 基因变异影响抗生素敏感性；USA 2 的 BIM 中，amiB 基因变异可能与美罗培南敏感性增加和噬菌体抗性有关，但需进一步研究。此外，部分变异可能影响细菌毒力因子表达。
5. 研究局限性与临床意义：本研究使用噬菌体鸡尾酒，无法区分单个噬菌体的作用。临床研究中对 BIMs 的报告较少，其临床意义尚不清楚。但本研究为噬菌体疗法和抗菌治疗提供了重要信息，有望改善治疗效果。

综上所述，本研究鉴定出铜绿假单胞菌临床分离株对噬菌体产生抗性后的基因组变化，包括噬菌体受体、前噬菌体、毒力因子和抗生素抗性相关基因的变异，这些发现有助于优化噬菌体疗法和抗菌治疗策略。