揭秘腺病毒 26 型载体疫苗免疫应答早期时空演化：为疫苗设计筑牢关键根基

《Journal of Virology 4.0》：Early spatiotemporal evolution of the immune response elicited by adenovirus serotype 26 vector vaccination in mice

本文利用小鼠模型研究腺病毒 26 型（Ad26）载体疫苗接种后 24 小时内免疫应答的时空演化。发现 Ad26 疫苗接种 1 小时内启动先天免疫应答，6 小时血清细胞因子与疫苗诱导的 CD8+ T 细胞记忆反应相关，为疫苗研究提供新视角。

　　### 引言
先天免疫在抵御感染和启动适应性免疫中起关键作用。腺病毒（Ad）载体广泛用于疫苗研发，能诱导强烈的 CD8⁺ T 细胞应答，可用于 T 细胞疫苗和治疗性癌症疫苗。以往研究多局限于外周血，对组织中早期免疫应答动力学研究不足。本研究旨在阐明 Ad 载体疫苗接种后早期免疫应答的时空演化，探究影响 T 细胞疫苗免疫原性的因素。

结果

1. Ad26 载体疫苗接种后免疫应答在 24 小时内启动：给 C57BL/6 小鼠肌肉注射表达 SIVgag 的 Ad26 疫苗载体（Ad26-SIVgag），在接种后 1、3、6、12、24 和 72 小时采集血清检测细胞因子和趋化因子。结果显示，3 小时时 IL-6 显著升高，6 小时时多种细胞因子和趋化因子达到峰值，24 小时后开始减弱，72 小时接近基线。这表明肌肉注射 Ad26 疫苗后，细胞因子和趋化因子迅速短暂诱导，协调免疫应答启动和整合。
2. Ad26 载体疫苗接种后 24 小时内多种免疫途径在血液和组织中快速演化：采集血液、肌肉和引流髂淋巴结（dLN）进行批量 RNA 测序转录组分析。结果发现，接种后 1 小时，肌肉和 dLN 中多种细胞因子、趋化因子及其下游信号通路显著上调，72 小时时 dLN 和血液中这些通路大多下调，而肌肉中部分通路仍持续存在。不同组织中细胞因子和趋化因子基因表达存在差异，肌肉中促炎和抗炎基因早期上调，dLN 中与淋巴细胞反应和转运相关的基因上调，血液中与免疫增殖相关的基因上调。此外，各组织中干扰素相关通路均显著上调，dLN 中 1 小时开始产生 IFN-α，3 小时后全身干扰素通路上调。这些结果表明，Ad26 肌肉接种后 1 小时，免疫信号通路在注射部位和 dLN 迅速富集，血液不能完全反映免疫应答程度。
3. 髓样细胞是 Ad26 肌肉接种的早期应答者：分析免疫细胞群体相关通路发现，接种后 1 小时肌肉中 M1 巨噬细胞和活化树突状细胞（DC）信号通路富集，3 小时 dLN 中富集，6 小时血液中富集。dLN 中 6 小时时活化 DC 通路持续富集，提示 DC 活化和成熟。通过流式细胞术检测发现，接种后 1 小时肌肉中 CD11b⁺Ly6C⁺免疫细胞频率增加，12 小时后 CD45⁺细胞逐渐增加；6 小时 dLN 中出现 CD11b⁺Ly6C⁺CD64⁺细胞群体。DC 表面共刺激分子在接种后 3 - 6 小时表达增加，72 小时降低。这些表明髓样细胞在接种后数小时内迅速迁移到肌肉注射部位，在启动免疫应答中起重要作用。
4. Ad26 接种后 6 小时可塑造 CD8⁺ T 细胞免疫原性：接种 Ad26-SIVgag 后 6 小时采集血清检测细胞因子，60 天后检测血液和组织中 SIVgag 特异性 CD8⁺ T 细胞应答。发现血清中 IL-6、MIG/CXCL9、MIP-1α、MIP-1β 和 TNF-α 水平与 60 天后 CD8⁺ T 细胞频率正相关。这表明接种后 6 小时的免疫事件可能塑造 Ad26 疫苗诱导的 CD8⁺ T 细胞应答，包括记忆 T 细胞应答的产生。

讨论

Ad 载体作为疫苗平台能刺激强大免疫应答，但对其接种后早期免疫事件了解不足。本研究利用小鼠模型详细阐述了 Ad26 接种后 24 小时内血液和组织中早期免疫应答的演化。转录组分析显示，接种后 1 小时组织中 IL-1 和 IL-6 促炎通路富集，启动细胞因子和趋化因子表达增加，24 小时内免疫应答达到峰值。不同组织免疫应答存在共性和特异性，血液中先天免疫应答消退快，肌肉中持续存在，肌肉和 dLN 免疫应答协调性更强，仅检测血液不能完全反映疫苗免疫原性的关键免疫事件。研究还发现 6 小时血清中部分细胞因子与 60 天后 CD8⁺ T 细胞应答相关，提示这些细胞因子在 Ad26 疫苗诱导的 CD8⁺ T 细胞应答中可能起作用，但具体机制需进一步研究。本研究虽有局限性，如批量 RNA 测序无法捕获免疫细胞异质性，但为深入研究早期免疫诱导机制和合理疫苗设计提供了重要依据，未来应研究其他疫苗平台的早期免疫应答时空演化。

材料和方法

1. 免疫接种：选用雌性 C57BL/6 小鼠，经双侧后腿股四头肌肌肉注射 10¹⁰个 Ad26 病毒颗粒（vp）。通过剂量滴定实验确定该剂量能更好检测低水平免疫应答。
2. 转录组分析：采集组织样本置于 RNAlater，处理后提取总 RNA，评估 RNA 质量并制备 RNA 测序文库，进行测序。
3. RNA 测序分析：在 R 语言中进行数据处理和分析，包括过滤原始 RNA 计数、归一化、计算差异基因表达、评估通路活性等。
4. 免疫研究样本采集：采集血液、肌肉和 dLN 样本，不同实验样本处理方法不同。
5. 细胞因子和趋化因子检测：对血清样本进行处理后，使用 Milliplex Mouse 32 - plex 预混试剂盒检测细胞因子和趋化因子水平。
6. 流式细胞术：对单细胞悬液进行染色、洗涤、固定后，用流式细胞仪检测分析。
7. 统计分析：使用 GraphPad Prism 7 和 R 语言相关软件包对免疫数据进行统计分析。