编辑推荐：
为解决蛋白酶体及 N 端亲核酶的催化机制问题，研究人员开展了对蛋白酶体和鸟氨酸乙酰转移酶 Arg7 的研究。结果发现蛋白酶体利用催化五联体机制，且该机制在 Arg7 中类似，患者相关突变影响其功能。这为理解相关疾病机制提供依据。
在生命的微观世界里，蛋白酶就像一群勤劳的 “分子剪刀”，时刻忙碌着对蛋白质进行精准切割，维持细胞内环境的稳定。蛋白酶的种类繁多，根据活性位点亲核试剂的不同，可分为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和金属蛋白酶等。其中，苏氨酸蛋白酶作为相对较新发现的成员，属于 N 端亲核酶家族，直到上世纪 90 年代才被人们所认识。
N 端亲核酶有着独特的 “工作方式”，其催化苏氨酸必须暴露在蛋白质的 N 端，所以这类酶最初是以无活性的前体形式合成，带有 N 端前肽。只有当前肽通过自催化裂解去除后，酶才会被激活，发挥其功能。在众多苏氨酸蛋白酶中，蛋白酶体（proteasome）是最为人熟知的，它是一种多亚基复合物，承担着细胞内大部分非溶酶体途径的蛋白质降解任务。蛋白酶体的核心颗粒（CP）就像一个 “分子加工厂”，由四个堆叠的异源七聚体环组成，呈 α7β7β7α7的排列方式，其中包含三个不同的蛋白水解亚基 β1、β2 和 β5，它们能够分别在疏水、碱性和酸性氨基酸残基之后进行切割，这使得蛋白酶体拥有异常广泛的底物识别范围。
尽管科学家们对蛋白酶体等 N 端亲核酶的研究已经取得了不少进展，但仍有许多关键问题尚未解决。比如，N 端亲核酶的催化机制究竟是怎样的？它们与传统蛋白酶的催化机制有何不同？此外，人类中出现了一类由蛋白酶体（CP）基因突变引起的疾病 —— 蛋白酶体病（proteasomopathies），这些突变如何影响蛋白酶体的功能，进而导致疾病的发生，目前也知之甚少。为了深入探究这些问题，来自哈佛医学院（Harvard Medical School）等机构的研究人员展开了一系列研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。结构分析方面，利用冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了蛋白酶体在不同组装阶段的结构，为研究其催化机制提供了直观的结构信息。在功能验证实验中，运用定点突变技术对相关基因进行突变，构建突变体酵母菌株，通过观察酵母的生长表型、分析蛋白酶体的组装和活性变化，来探究特定氨基酸残基在催化过程中的作用。同时，借助蛋白质纯化和分析技术，如亲和纯化、SDS-PAGE 电泳、免疫印迹等，对蛋白酶体进行分离、鉴定和定量分析，明确其组成和功能状态。
蛋白酶体自催化激活的结构特征
研究人员此前通过冷冻电镜获得了蛋白酶体前体（pre-15S）的结构，发现该前体在形成 β-β 中线界面的互补片段存在一些未解析区域。在 β2 和 β5 等活性位点亚基中，有两个未解析的环，其中一个环包含传统催化三联体（threonine、lysine 和 aspartate）中的部分残基，在 CP 融合前，这些催化三联体残基未对齐。而另一半 CP 融合时，这些相关片段会发生无序到有序的转变，使得催化三联体残基对齐，从而驱动自催化激活。然而，β2 和 β5 中的第二个未解析环无法用之前的机制解释，因为它们位于苏氨酸活性位点的另一侧，不能调节传统催化三联体，但这两个环中分别含有保守的 Ser/Asp 对（β2-Ser158/Asp195 和 β5-Ser206/Asp243），且它们与活性位点苏氨酸距离很近。
Ser/Asp 残基对 β2 自催化激活和蛋白水解至关重要
研究人员对 β2 中的 Ser158 和 Asp195 进行突变研究。S158A 突变体在无压力条件下生长受损，D195A 突变体则完全无法存活，更为保守的 D195N 突变体虽然能够存活，但也表现出严重的生长缺陷。对这些突变体的 CP 进行纯化分析发现，S158A 和 D195N 突变体中出现了前全蛋白酶体（preholoproteasome）的积累，且 D195N 突变体还积累了亚 20S 中间体。通过荧光底物检测蛋白酶体活性，发现 S158A 和 D195A 突变体的 β2 活性几乎完全丧失，D195N 突变体的 β1 和 β5 活性也部分丧失。此外，这些突变体中，感知细胞蛋白酶体容量的转录因子 Rpn4 水平显著升高，表明蛋白酶体功能存在重大缺陷。这一系列实验结果表明，Ser158 和 Asp195 在 β2 的自催化激活和底物蛋白水解过程中发挥着不可或缺的作用。
β5 和 β1 中类似的五联体排列
β5 中的 Ser206 和 Asp243 与活性位点苏氨酸形成氢键，排列方式与 β2 类似。D243A 突变体在无外源压力下就表现出生长缺陷，S206A/D243A 双突变体的表型更为严重。对双突变体的 CP 进行纯化分析，发现存在前全蛋白酶体积累，β5 的蛋白水解活性几乎完全丧失，而 β2 和 β1 的功能接近野生型。通过环己酰亚胺追踪实验监测 β5 的成熟过程，发现野生型细胞中未成熟 β5 快速消失，而突变体中 β5 的周转速度明显减慢，稳态水平升高。β1 中也存在类似的五联体残基排列，虽然在非压力条件下未观察到表型缺陷，但在刀豆氨酸处理后，D185A 突变体出现明显表型，S148A/D185A 双突变体的前全蛋白酶体丰度增加，β1 的蛋白水解活性近乎完全丧失，且对 β1 亚基具有高度特异性。这些结果表明，β2、β5 和 β1 中的 Ser/Asp 对都靠近活性位点苏氨酸，对自催化激活和位点特异性底物蛋白水解是必需的。
鸟氨酸乙酰转移酶 Arg7 采用类似的催化五联体机制
研究人员想探究这种催化五联体机制是否仅存在于蛋白酶体中，还是 N 端亲核酶的普遍特征。他们选择了鸟氨酸乙酰转移酶 Arg7 进行研究，该酶在精氨酸生物合成中发挥作用，且需要自催化裂解来暴露其活性位点 Thr215。虽然缺乏酵母 Arg7 的结构数据，但细菌同源物 ArgJ 的晶体结构显示，其存在一组与蛋白酶体中排列惊人相似的五个残基，包括一对 Lys/Asp 和一对 Ser/Asp，且都与活性位点形成氢键，这五个残基在进化上高度保守。对 Arg7 的五联体残基进行突变研究，发现突变体在缺乏精氨酸的培养基中生长能力与催化失活的 T215A 突变体相似，都严重受损。通过免疫印迹监测 Arg7 的成熟过程，发现除 T215A 突变体外，其他四个五联体残基突变体也都存在成熟缺陷，在细菌中表达重组 Arg7 时，同样观察到所有突变体的自催化激活存在重大缺陷。这表明催化五联体机制在 Arg7 的功能和自催化激活中起着关键作用，可能是 N 端亲核酶的一个普遍特征。
第二三联体功能缺陷可能解释部分人类蛋白酶体病
人类中存在一类由蛋白酶体突变引起的疾病，已鉴定出 40 多种突变，但这些突变对蛋白酶体功能和细胞生理学的具体影响大多未知。研究人员对两个患者来源的蛋白酶体突变进行研究，一个是在免疫蛋白酶体 β5i 亚基中的 G201V 突变，在酵母中对应的是 G205V 突变，该突变致死，更为保守的 G205A 突变体在无压力条件下有轻微表型，在蛋白毒性压力下表现出强烈表型。纯化该突变体的 CP 发现前全蛋白酶体大量积累，β5 催化活性严重缺陷，但 β2 和 β1 活性无明显变化，β5 成熟速率也显著降低。另一个是在免疫蛋白酶体 β2i 亚基中的 G201R 突变，在酵母中对应的是 G191R 突变，该突变致死，G191V 突变也致死，G191A 突变体在基础条件下无生长缺陷，在蛋白毒性压力下出现生长缺陷，其纯化的 CP 虽无明显结构异常，但 β2 的蛋白水解活性存在显著且特异性的缺陷。这表明这些突变影响了催化五联体中 Ser/Asp 对的功能，进而导致蛋白酶体功能异常，可能与部分人类蛋白酶体病的发生有关。
研究人员通过对蛋白酶体和鸟氨酸乙酰转移酶 Arg7 的深入研究，发现蛋白酶体利用一种独特的催化五联体机制进行自催化激活和底物蛋白水解，这种机制在其他 N 端亲核酶如 Arg7 中也存在。同时，研究还表明患者来源的蛋白酶体突变可能通过影响催化五联体中 Ser/Asp 对的功能，导致蛋白酶体功能受损，为理解人类蛋白酶体病的发病机制提供了重要线索。这一研究成果不仅丰富了人们对 N 端亲核酶催化机制的认识，也为开发针对相关疾病的治疗方法奠定了理论基础，有望在未来为这些疾病的治疗带来新的突破。
