鼻喷式 PIV5 载体新冠疫苗（CVXGA1）在非人灵长类动物中诱导持久保护免疫

《Journal of Virology 4.0》：A parainfluenza virus 5 (PIV5)-vectored intranasal SARS-CoV-2 vaccine (CVXGA1) elicits protective and long-lasting immunity in nonhuman primates

新冠疫情反复，现有疫苗存在免疫衰减等问题。本文研究的鼻内接种副流感病毒 5（PIV5）载体新冠疫苗（CVXGA1），在非洲绿猴模型中展现出诱导黏膜、体液和细胞免疫应答的能力，能提供持久保护，为新冠疫苗研发带来新希望。

　　

引言

SARS-CoV-2 引发的 COVID-19 大流行，全球已超 760 亿人感染，690 万人死亡。美国虽批准了 4 种疫苗，全球接种超 130 亿剂，但现有疫苗存在免疫衰减和黏膜免疫有限的问题，人们仍易感染，急需新型疫苗。非洲绿猴（AGM）模型常用于评估疫苗免疫反应和效果，其感染 SARS-CoV-2 后有类似人类症状，还能产生中和抗体和细胞免疫反应。副流感病毒 5（PIV5）属副黏病毒科，是单链负义 RNA 病毒，已被用作多种呼吸道病毒疫苗的载体。此前研究显示，单剂量鼻内接种 CVXGA1 可保护雪貂免受 SARS-CoV-2 感染和传播，但它诱导的细胞和黏膜免疫效果尚未明确。本研究旨在探究 CVXGA1 在 AGM 中的免疫持久性和保护效果，以及诱导黏膜抗体和多功能细胞反应的能力。

材料和方法

1. 细胞和病毒：Vero E6 细胞用含 5% 胎牛血清（FBS）等的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）培养，无血清 Vero 细胞用 VP-SFM 培养基培养。CVXGA1 疫苗病毒是将 SARS-CoV-2 的 S 基因插入 PIV5 基因组构建而成，SARS-CoV-2 WA1 株从 BEI Resources 获取。
2. AGM 免疫和攻毒：AGM 从圣基茨野生捕获，饲养在路易斯安那大学拉斐特分校新伊比利亚研究中心的动物生物安全二级（ABSL - 2）设施中。设置不同的 AGM 研究，研究 1 评估 CVXGA1 的抗体反应和对 SARS-CoV-2 攻毒的保护作用；研究 2 评估保护效果和攻毒病毒组织分布；研究 3 分为 A、B 两个子研究，3A 评估对 α 变异株异源攻毒的保护效果，3B 评估免疫应答的持久性和加强免疫效果。攻毒前将 AGM 转移到佐治亚大学（UGA）的 ABSL - 3 设施，用 Teleflex MAD 鼻腔黏膜雾化装置将 SARS-CoV-2 WA1 攻毒病毒（0.5 mL，4×10⁶ PFU/mL）经鼻孔接种。
3. AGM 样本采集：通过麻醉或安乐死采集样本。血液从股静脉、头静脉或隐静脉采集；用无菌海绵收集鼻腔黏膜液；经气管插管注入生理盐水收集支气管肺泡灌洗液（BAL）；死后采集组织样本，处理后保存。
4. 检测方法：采用免疫组织化学（IHC）检测组织中 SARS-CoV-2 抗原；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清和黏膜液中的抗体；微量中和试验检测体液中的中和抗体；细胞内细胞因子染色（ICS）和流式细胞术分析 T 细胞免疫反应；IFN-γ 酶联免疫斑点试验（ELISpot）检测细胞毒性 T 细胞（CTL）反应；采用焦点形成单位（FFU）试验和噬斑试验检测病毒载量；RT-qPCR 检测病毒 RNA 水平。统计分析使用 Prism 9.3.1 软件，不同实验采用相应的统计检验方法。

结果

1. 鼻内接种 CVXGA1 诱导 AGM 产生强大免疫反应：给 AGM 鼻内接种单剂量 10⁶ PFU 的 CVXGA1 后，监测鼻腔洗液发现疫苗在接种后第 5 天病毒 shedding 达到峰值，随后下降，第 14 天检测不到。接种后第 28 天和 36 天，疫苗组 SARS-CoV-2 S 特异性 IgG 抗体平均滴度大于 5 log₁₀ ，中和抗体平均滴度大于 2 log₁₀ 。疫苗组 S 特异性 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞反应显著增加，主要分泌 IFN-γ、TNF-α 或 CD107α ，而非 MIP-β 或 IL-13。同时，疫苗组在上呼吸道（第 28 天）和下呼吸道（第 15 天）均产生了 S 特异性 IgA 抗体，表明诱导了黏膜免疫反应。
2. 鼻内接种 CVXGA1 保护非洲绿猴免受 SARS-CoV-2 攻毒：AGM 接种 CVXGA1 36 天后用 SARS-CoV-2 攻毒，未接种组鼻腔洗液在攻毒后第 1 天和第 3 天检测到病毒 RNA ，而疫苗组第 3 天病毒 RNA 显著减少。未接种组 BAL 在攻毒后第 1 天有传染性病毒，疫苗组仅 2 只检测到病毒且滴度低。研究 2 中，未接种组攻毒后 2 天和 4 天，多个组织有传染性病毒，而疫苗组均未检测到。研究 3A 中，接种 CVXGA1 的 AGM 在感染 α 变异株后，与对照组相比，鼻甲骨和肺部的病理变化和病毒载量降低，表明 CVXGA1 对 SARS-CoV-2 武汉株和 α 变异株攻毒有保护作用，可减轻肺部疾病病理。
3. 鼻内接种 CVXGA1 诱导 AGM 产生持久的体液免疫反应：在 AGM 研究 3B 中，不同剂量（10⁵、10⁶、10⁷ PFU）接种 CVXGA1 后，第 28 天所有 AGM 均产生高水平的 SARS-CoV-2 IgG 和 IgA 抗体。接种前血清 SARS-CoV-2 抗体阳性的 AGM ，接种后抗体滴度至少增加 10 倍。疫苗组在 245 天内抗体滴度保持稳定，表明诱导了持久的抗体反应。
4. 鼻内接种 CVXGA1 诱导 AGM 产生长期的细胞免疫反应：检测不同时间点 AGM 的细胞免疫反应，发现接种 CVXGA1 后，产生了高水平分泌 IFN-γ、TNF-α、MIP-β 或 CD107α ，低水平分泌 IL-13 的 S 特异性 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞，呈现 1 型免疫反应。较高剂量（10⁷ PFU）接种诱导的 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞反应更强。ELISpot 试验显示，接种后第 28 天 IFN-γ 分泌细胞达到峰值，加强免疫后，IFN-γ 分泌细胞在第 70 天仍维持较高水平，表明诱导了长期的细胞免疫反应。

讨论

目前批准的 COVID-19 疫苗虽能减少疾病、住院和死亡，但 mRNA 疫苗免疫反应存在血清中和抗体下降快、黏膜和细胞免疫反应有限的问题。本研究中，鼻内接种 CVXGA1 在 AGM 中诱导了黏膜 IgA 抗体反应，这对预防 SARS-CoV-2 感染和传播至关重要。同时，CVXGA1 诱导了强大的细胞免疫反应，包括 S 特异性 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞，以及高水平的 IFN-γ 分泌 CTL 反应，且呈现 1 型免疫反应，有望对变异株提供交叉保护。尽管本研究挑战模型不如以往研究，未接种组鼻腔洗液未检测到感染性病毒，但仍能检测到病毒 RNA 和下呼吸道感染性病毒，且 CVXGA1 接种组能更快清除病毒。研究还发现，CVXGA1 诱导的免疫反应持久，能增强已有免疫个体的免疫反应，且第二剂可增强血清 IgA 抗体和细胞免疫反应的持久性。不过，约 30% 的人群有抗 PIV5 抗体，其对疫苗免疫原性的影响正在临床试验中研究。总体而言，单剂量鼻内接种 CVXGA1 可在 AGM 中诱导黏膜、体液和细胞免疫反应，提供对 SARS-CoV-2 攻毒的保护，免疫持久，有望减少病毒传播和新变异株出现，还可通过更新 S 蛋白基因增强对未来变异株的免疫力。