利用细胞特征数学描述符实现成纤维细胞表型的自动化预测

《Nature Communications》：Automated prediction of fibroblast phenotypes using mathematical descriptors of cellular features

为解决成纤维细胞表型分级难题，研究人员开发定量分析方法，能准确预测表型，助力纤维化疾病研究。

　　在人体的组织器官中，有一种名为成纤维细胞的 “小卫士”，它在伤口愈合等过程中发挥着重要作用。然而，当身体受到反复或严重损伤时，成纤维细胞会发生 “变身”，转变为肌成纤维细胞。这种变化看似不起眼，却可能引发大问题 —— 纤维化。纤维化就像器官的一场 “灾难”，它几乎能影响到心脏、肾脏、肝脏等任何器官，据统计，近 45% 的死亡都与它有关。而且，在肿瘤转移的过程中，纤维化和癌症相关的成纤维细胞也在 “暗中作祟”。

目前，针对纤维化的治疗药物少之又少，仅 OFEV?（nintedanib）和 Esbriet?（pirfenidone）获批用于治疗特发性肺纤维化（IPF）。在研究纤维化的过程中，成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变至关重要，但现有的成纤维细胞表型分级方法存在诸多问题。传统方法主要依靠研究人员或病理学家主观判断，通过免疫染色观察 α- 平滑肌肌动蛋白（αSMA）形成的离散应力纤维来分级，这种方式不仅主观，还容易受到抗体来源、染色方案以及显微镜和成像参数的影响。同时，细胞形态等重要信息在表型分析中常常被忽视。虽然也有研究尝试用神经网络或细胞形态来分类，但都存在各自的缺陷，比如神经网络需要大量训练数据，且预测基于抽象特征难以解释；现有的基于细胞形态的方法又无法结合 αSMA 应力纤维结构来分级。

为了解决这些难题，来自美国科罗拉多大学博尔德分校（University of Colorado Boulder）的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为纤维化疾病的研究和治疗带来了新的希望。

研究人员采用了多种关键技术方法。在样本处理方面，从猪主动脉瓣分离出瓣膜间质细胞（VICs），从成年大鼠心室分离出心脏成纤维细胞（CFs）。在细胞培养过程中，通过在不同硬度的水凝胶基质上培养细胞，模拟健康和纤维化组织微环境。对于细胞的检测，运用免疫染色和成像技术，对细胞进行固定、染色后，使用 Operetta 高 - content 共聚焦显微镜成像。在数据分析阶段，借助傅里叶级数（Fourier series）对细胞和细胞核形状进行数学描述，通过计算相干性（c）来量化 αSMA 应力纤维的各向异性，还利用主成分分析（PCA）和逻辑回归模型等对数据进行深入分析。

下面来看看具体的研究结果：

1. 细胞和细胞核形状的数学描述：研究人员运用傅里叶分析，成功地对细胞和细胞核形状进行了数学描述，并能通过优化后的傅里叶系数准确重建它们的边界。通过实验确定，分别用 15 次谐波（共 62 个系数）和 5 次谐波（共 22 个系数）就足以重建细胞体和细胞核。这一方法不仅减少了分析的变量数量，还能有效还原细胞和细胞核的自然平滑边界，避免了成像和数字化过程中离散像素带来的失真。
2. αSMA 应力纤维结构的量化：为了更准确地研究 αSMA 应力纤维，研究人员计算了相干性（c）。c 能反映 αSMA 应力纤维的局部各向异性程度，其值在 0 到 1 之间。c 不受绝对荧光强度、焦平面距离和像素分辨率的影响，计算每个 VIC 的中值 c 作为整体各向异性程度（DOA）的指标。通过对比发现，DOA 与传统的 VIC 表型分级结果相符，为 VIC 表型的量化提供了一种可靠的替代方法。
3. 与 VIC 激活相关的形态学特征提取：研究人员在软（E=?5kPa）和硬（E=~13 kPa）水凝胶基质上培养 VICs，生成数据集。通过 PCA 分析发现，细胞和细胞核的面积、长宽比与 DOA 相关，而细胞和细胞核的长度与之无关。并且，细胞面积和长宽比、细胞核面积和长宽比之间无显著相关性，说明它们是相互独立的形态学特征。
4. 可分级 VIC 表型的特征选择和验证：基于上述发现，研究人员针对细胞和细胞核面积、长宽比以及 DOA 等特征，分别建立逻辑回归模型，还构建了多变量逻辑回归（MLR）模型。通过 ROC 曲线评估模型性能，结果显示细胞面积、细胞核面积、DOA 和 MLR 模型的 AUC 较高，是分级 VIC 表型的合适变量。在 k 折交叉验证中，DOA 和 MLR 模型表现出色，准确率分别达到 83±2% 和 84±2%。
5. 模型在测试数据集上的性能：将训练好的逻辑回归模型用于药物筛选测试数据集。在对用 5 - 氮杂胞苷（5-azacytidine，AZA）处理的 VICs 测试中，相关模型能较好地预测 VICs 表型，结果表明 AZA 可能通过抑制肌成纤维细胞激活来预防纤维化。在用 bpV (HOpic) 处理的 VICs 测试中，DOA 和 MLR 模型同样表现优秀，反映出 bpV (HOpic) 能促进肌成纤维细胞激活。这两个药物筛选实验都表明，PTEN 促进 VICs 静止，是抗纤维化的潜在药物靶点。
6. 与其他方法的对比：与先前的形状分析方法相比，研究人员使用的傅里叶形状重建方法在重建复杂细胞形状时表现更优，能更准确地还原细胞形状，且所需模型参数更少。与深度学习模型相比，研究人员开发的 MLR 模型在量化静止和激活的成纤维细胞方面更准确，且方法更简单、可解释性更强。与高维细胞表型分析软件 CellProfiler 相比，研究人员的 DOA 变量在量化 αSMA 表达方面表现更出色，且整个方法所需的维度更少。

研究人员开发的这种结合细胞形态和 αSMA 应力纤维信息的定量分析方法，能够准确预测成纤维细胞表型。它不仅减少了人为偏差，还为药物筛选提供了一种高通量的方法，有助于加速纤维化疾病候选治疗药物的发现。而且，该方法可拓展到 3D 成像数据、其他成纤维细胞类型以及明场图像的分析，有望通过分析患者样本中的细胞和细胞核形态，进一步推动纤维化领域的研究。