新型双重一步重组酶辅助 PCR 技术助力血液念珠菌快速检测

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Dual one-step recombinase-aided PCR for rapid detection of Candida in blood

研究人员为解决念珠菌血流感染检测难题，开展 DO-RAP 联合 M1 磁珠检测研究，显著提升检测效能。

　　在医学领域，念珠菌引发的感染如同隐藏在暗处的 “健康杀手”，悄无声息地威胁着人们的生命健康。近年来，随着免疫功能低下人群数量的增加，如器官移植受者、艾滋病患者等，念珠菌感染的发生率和死亡率呈显著上升趋势。念珠菌可引发从皮肤黏膜的浅表感染到危及生命的侵袭性感染等多种疾病，其中念珠菌血流感染（Bloodstream infections，BSIs）最为严重，其死亡率高达 35 - 80% ，全球每年约有 150 万人因此丧生。

面对如此严峻的形势，早期准确诊断念珠菌感染至关重要，因为这直接关系到患者能否及时接受有效的抗菌治疗，从而改善预后。然而，当前的分子检测方法，如 PCR、T2 念珠菌检测面板（T2 Candida panel）和测序技术等，虽能在一定程度上缩短检测时间，但因灵敏度有限或成本高昂，无法广泛应用于临床。

为了突破这些困境，来自河北北方学院研究生院、河北省人民医院检验科、河北医科大学研究生院、中国疾病预防控制中心传染病智能跟踪与预测国家重点实验室等机构的研究人员，开展了一项旨在开发新型检测方法的研究。他们成功建立了双重一步重组酶辅助 PCR（Dual one-step recombinase-aided PCR，DO-RAP）方法，并将其与重组人甘露聚糖结合凝集素蛋白（rhMBL，即 M1 蛋白）偶联磁珠（M1 bead）富集技术相结合，用于克鲁斯念珠菌（Candida krusei）和近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）血流感染的早期检测。该研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志上。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先是样本采集与处理，从健康志愿者获取血浆用于模拟样本制备，同时收集临床血液标本用于方法验证。其次是设计针对念珠菌特定基因的引物和探针，并构建重组质粒。然后利用 DO-RAP 技术进行核酸扩增，结合 M1 磁珠富集病原体，通过优化反应条件，包括镁离子浓度、PCR 退火时间和 RAA 反应时间等，提高检测的灵敏度和特异性。最后采用定量 PCR（qPCR）作为对照方法，对比分析两种方法在不同样本中的检测效果。

在优化反应条件的研究中，研究人员发现镁离子浓度为 8 mM 时，能使 DO-RAP 反应中的 RAA 和 qPCR 反应都达到最佳效果；PCR 退火时间为 40 s 时，在保证检测效率的同时可缩短整体反应时间；RAA 反应时间为 10 min 时，既能提高效率又能减少总反应时长。

对 DO-RAP 方法的性能评估显示，该方法具有高灵敏度和良好的重复性。以重组质粒为模板时，对克鲁斯念珠菌和近平滑念珠菌的检测限均为 1 copy/μL；以基因组 DNA 为模板时，检测限为 10^-7 ng/μL。并且多次重复检测表明，该方法能够稳定检测到 100 copy/μL 的样本。同时，DO-RAP 方法特异性强，与其他微生物病原体的基因组 DNA 无交叉反应。

与 qPCR 相比，DO-RAP 在检测模拟样本时表现更优。在 M1 磁珠富集前，DO-RAP 对克鲁斯念珠菌和近平滑念珠菌的检测限分别为 100 CFU/mL 和 50 - 100 CFU/mL，而 qPCR 的检测限分别为 300 CFU/mL 和 500 CFU/mL；富集后，DO-RAP 的检测限降至 1 CFU/mL，qPCR 则为 3 CFU/mL（克鲁斯念珠菌）和 5 CFU/mL（近平滑念珠菌）。

在临床样本检测中，DO-RAP 与 qPCR 的检测结果一致性良好，Kappa 值分别为 0.936（克鲁斯念珠菌）和 0.904（近平滑念珠菌），且 P<0.05，表明两种方法检测结果高度相符。

综合研究结果与讨论，DO-RAP 联合 M1 磁珠富集技术为念珠菌血流感染的检测带来了新突破。该技术不仅简化了操作流程，去除了传统方法中使用的二十二烷（docosane），还大幅提高了检测速度和灵敏度，能够在 3.5 h 内得出可靠结果，且无需繁琐的预培养步骤。这一成果为侵袭性念珠菌感染的早期诊断和治疗干预提供了重要的技术支持，具有显著的临床应用价值。尽管该技术还存在一些局限性，如 RAA 阶段的副产物可能影响 qPCR 扩增效率等，但随着进一步优化，有望在临床和科研领域得到更广泛的应用，为应对念珠菌感染这一全球性健康挑战提供有力武器。