综述：双疏水弹性蛋白样多肽通过凝聚作用自组装形成的纳米纤维和水凝胶

《Polymer Journal》：Self-assembled nanofibers and hydrogels of double-hydrophobic elastin-like polypeptides formed via coacervation

本文聚焦弹性蛋白样多肽（ELPs），阐述其相分离、自组装及在生物医学的应用进展。

　　

引言

在众多生物系统中，发生液 - 液相分离（LLPS）形成致密液滴（凝聚层）的蛋白质发挥着关键作用，比如调节细胞功能和组织发育。原弹性蛋白作为弹性蛋白的可溶性前体，是一种典型的能形成凝聚层的蛋白，它会响应温度、盐浓度等多种刺激。弹性蛋白是细胞外基质（ECM）的重要组成部分，广泛存在于血管、肺、韧带和皮肤等组织中，能形成弹性纤维网络，承受反复的应力和松弛。原弹性蛋白的 LLPS 过程被认为是弹性纤维形成的关键步骤，其分泌到细胞外后，会先形成凝聚层沉积在原纤维蛋白上，再经过酶介导的分子间交联，最终生成成熟的弹性蛋白。

原弹性蛋白是一种分子量在 60 - 70kDa 的蛋白质，由高度重复的氨基酸序列构成，包含富含脯氨酸的疏水区、富含甘氨酸的疏水区和交联区这三种结构域。富含脯氨酸的疏水区富含脯氨酸（P）和甘氨酸（G），这两种氨基酸是破坏结构的残基，使得该区域本质上无序；而富含甘氨酸的疏水区具有重复基序Z1?GGZ2?G（Z 为缬氨酸（V）或亮氨酸（L）），倾向于形成 β - 折叠结构。交联区则富含赖氨酸（K）残基，其伯胺参与分子间交联。原弹性蛋白呈现出低临界溶液温度（LCST）型相分离特性，低温下可溶，高温时形成凝聚层。弹性蛋白样多肽（ELPs）是具有原弹性蛋白简化重复序列的合成或基因工程蛋白，同样具有 LCST 型相分离行为，其 LCST 可通过 X 的组成和 ELP 的分子量进行微调。

ELP 凝聚层不仅在生物学基础研究中意义重大，在生物工程和纳米医学领域也展现出巨大潜力，可作为创新材料平台。例如，它被用作重组蛋白的纯化标签、刺激响应性药物递送载体，还能用于核酸分离、构建人工细胞内可逆触发的区室以及在活细胞中生成人工无膜细胞器等。不过，虽然 VPGXG 重复序列的 ELPs 相转变行为通常被认为是可逆的，但更接近原弹性蛋白的合成蛋白凝聚层，在不同时间尺度下会发生不可逆的成熟过程。

研究人员设计出 “双疏水” 型 ELPs，模仿原弹性蛋白中富含甘氨酸和富含脯氨酸疏水区的不均匀分布，这种 ELPs 能通过凝聚作用自组装形成纳米纤维，进而相互连接。下面将详细介绍这些纳米纤维的形成机制和应用。

双疏水 ELPs 的自组装

在 40°C 的水溶液中孵育时，原弹性蛋白会自组装成直径约 5nm 的各向异性组装丝束状结构，这表明原弹性蛋白序列具备独特的纤维状自组装分子机制。从其结构域来看，富含脯氨酸的序列位于蛋白中心，富含甘氨酸的序列则在两端。基于此，研究人员设计并基因工程改造出一种名为 GPG 的双疏水 ELP，以简化原弹性蛋白中异质结构域的定位。GPG 含有一个富含脯氨酸的中心序列(VPG[V0.8? F0.2?]G)25?（F 为苯丙氨酸），两侧是富含甘氨酸的序列(VGGVG) ，并在 C 末端融合了一个寡组氨酸标签，方便通过柱层析进行纯化。

将 GPG（20μM）溶解在冷水中，然后加热到 45°C（高于其转变温度，约 20°C），圆二色谱（CD）分析显示，16°C 时 GPG 主要呈无序结构，含有一些 β - 转角；45°C 时则迅速转变为富含 β - 转角的结构。在 45°C 继续孵育一周，会逐渐形成 β - 折叠结构。通过原子力显微镜（AFM）观察发现，升温到 45°C 后不久，会出现直径 130 - 200nm 的球形纳米颗粒；1 天后，颗粒密度显著增加，平均直径减小，同时视野中开始出现纤维；2 天后，仅能观察到纳米纤维；到第 7 天，成熟的纳米纤维直径为 20 - 70nm，长度超过 10μm，呈现出串珠状形态。而且，即使在 45°C 长时间老化数月，纳米纤维分散液仍保持透明，未出现沉淀，显示出良好的胶体稳定性。

为验证双疏水分子设计的重要性，研究人员使用单嵌段或双嵌段多肽进行对照实验。单独的富含脯氨酸多肽(VPG[V0.8? F0.2?]G)25?加热后形成富含 β - 转角的纳米颗粒；富含甘氨酸的多肽(VGGVG)形成富含 β - 折叠的短纤维（长度 < 50nm） ，且这两种嵌段成分的二级结构和聚集结构很快达到平衡，不再随时间变化。而双嵌段多肽 PG（(VGGVG)仅在(VPG[V0.8? F0.2?]G)25?的 C 末端融合）能像 GPG 一样逐渐形成长纳米纤维，但纳米纤维中的 β - 折叠含量低于 GPG。另一种衍生物 GPPG（通过短连接序列重复两次富含脯氨酸序列(VPG[V0.8? F0.2?]G)25?）也能通过类似过程形成纳米纤维，不过其 AFM 测定的纤维直径略大，GPPG 为 55±11nm，GPG 为 42±8nm，说明分子大小与纤维直径相关。由此，研究人员提出了 GPG 纳米纤维形成的初步模型：加热时，GPG 发生相分离形成凝聚层，然后重新排列，亲水性的寡组氨酸标签促使相邻的(VGGVG)片段靠近凝聚层（颗粒）表面，导致颗粒压实；(VGGVG)片段形成分子间 β - 折叠，在颗粒组装成纤维时相互交错。β - 折叠形成相对较慢，可能是因为与(VPG[V0.8? F0.2?]G)25?相连的(VGGVG)运动性降低。

GPG 纳米纤维的形成在一定程度上是可逆的。将 45°C 孵育 7 天的 GPG 纳米纤维分散液冷却到 16°C 1 小时后，AFM 观察到有孤立的颗粒、短颗粒链以及部分残留的纳米纤维；即使在 16°C 孵育 24 小时，纳米纤维也不会完全消失。

三氟乙醇（TFE）会影响 GPG 的自组装。TFE 是一种有机溶剂，能提供低介电环境促进氢键形成，增加肽二级结构中 α - 螺旋和 β - 折叠的含量。在 TFE / 水混合物中，当 TFE 含量高达 30%（v/v）时，GPG 串珠状纳米纤维的形成会加速，在 30% TFE 浓度下，即使在 16°C，由于 β - 折叠结构快速形成，3 小时就能完成纳米纤维的形成；但当 TFE 浓度达到 60% 时，纳米纤维形成受到破坏，仅形成不规则聚集体，同时出现 α - 螺旋结构。

双疏水 ELPs 的功能衍生物及其应用

GPG 由 196 个氨基酸残基组成，在其末端添加短肽不会抑制其形成纳米纤维的能力。例如，将原弹性蛋白交联结构域中的 KAAK（A 为丙氨酸）肽基序融合到 GPG 的 C 末端，纳米纤维形成后，KAAK 基序中的伯胺可与双（磺基琥珀酰亚胺）辛二酸酯（BS3）发生化学交联。交联后的纳米纤维在转变温度范围内温度变化时保持稳定，而未交联的纳米纤维在 16°C 时会部分分解。

研究人员构建了一种在 GPG C 末端带有 KAAKGRGDS（R 为精氨酸，D 为天冬氨酸，S 为丝氨酸）肽的衍生物（GPG - RGD）。GRGDS 是一种源自纤连蛋白的细胞结合肽，对整合素α5β1和αvβ3具有高亲和力。将 GPG - RGD 纳米纤维分散液干燥涂覆在细胞培养板上，小鼠胚胎 NIH/3T3 成纤维细胞在 GPG - RGD 纳米纤维表面的黏附和增殖情况与阳性对照纤连蛋白相当，而在 GPG 或带有 KAAK 基序的 GPG 纳米纤维上，细胞黏附和增殖情况与聚苯乙烯细胞培养板相近，这表明亲水性的 GRGDS 基序暴露在纤维表面，能有效与细胞相互作用。

目前可用的合成血管移植物，如由膨体聚四氟乙烯或聚对苯二甲酸乙二酯制成的移植物，可作为病变血管的替代物，但由于随时间推移会出现通畅性丧失的问题，不适用于小直径（<6mm）的应用。弹性蛋白作为动脉中膜的主要 ECM 蛋白，具有合成血管移植物所需的理想特性，包括抗血栓形成性、维持血管平滑肌细胞（SMC）表型和适当的机械性能等。然而，生物来源的弹性蛋白存在加工性能差、批次间差异大的问题，而且在动物模型中还观察到植入后会发生钙化。GPG 的化学组成与弹性蛋白相似，能重现纤维状 ECM 结构，可能是小直径血管移植物的候选材料。为进一步使 GPG 适用于血管移植物，研究人员构建了带有 REDV（E 为谷氨酸）肽基序的新型衍生物。早期内皮化是血管移植物材料的另一重要要求，REDV 是一种能被内皮细胞（ECs）中存在的整合素α4β1特异性识别的肽。研究比较了 REDV 修饰的 GPG 纳米纤维与未修饰的 GPG、GPG - RGD、胶原蛋白和细胞培养玻璃纳米纤维的生物学特性，发现 REDV 修饰的 GPG 纳米纤维展现出作为血管移植物材料的理想生物学特性：抑制血小板黏附和激活、促进 EC 黏附和增殖、维持 SMC 的收缩表型以防止细胞过度生长导致内膜增生 。

由原弹性蛋白和 ELPs 的 LLPS 形成的水凝胶

由原弹性蛋白和 ELPs 组成的水凝胶，因其细胞相容性和可控的机械性能，作为再生医学的支架材料备受关注。LLPS 常被用于制备水凝胶，比如 Weiss 等人用 BS3 化学交联重组人原弹性蛋白（rTE）的凝聚层液滴，制备出弹性水凝胶，可支持上皮细胞在体外的附着和增殖，但细胞在水凝胶内的渗透程度有限。为克服这一局限，研究人员还制备了适用于原位细胞包封的光交联水凝胶，如使用甲基丙烯酰化原弹性蛋白（MeTro），MeTro 水凝胶已用于手术密封和构建仿生心脏组织。

通过 LLPS 也可构建物理交联的弹性蛋白样水凝胶。例如，(VPGXG)（X 为 V、G、A，比例为 5:3:2）在 37°C 凝聚形成凝胶相，其复数模量 | G*| 为 80Pa，在该凝胶相中培养的软骨细胞能维持其表型。具有不同温度响应的两亲性 ELP 嵌段共聚物可用于获得更连续的凝胶相，这种嵌段 ELP 在灵长类动静脉分流模型中展现出良好的血液接触性能，在体内引发的炎症反应极小，且能稳定存在一年以上。

通过浓缩 ELP 溶液的 “受阻相分离” 机制可获得极硬的物理水凝胶。通常，ELP 溶液加热会变浑浊，形成宏观相分离的富含多肽的聚集体；但将 XPGVG 第三位的 G 替换为 A 后，相分离过程在纳米尺度受阻，会在溶液中形成双连续网络，这是因为 G 到 A 的替换阻碍了凝聚层中折叠态的链动力学。例如，(([I0.2?V0.8?]PAVG)120（I 为异亮氨酸）在 20wt% 浓度下形成的水凝胶，其储能模量 G’ 超过 1MPa。一种带有含半胱氨酸（C）和 RGD 细胞黏附位点侧翼序列的遥爪衍生物也能形成水凝胶，巯基氧化可使 ELP 链延伸，形成可伸展的凝胶，包封在其中的软骨细胞在 28 天内仍保持活力。

能形成纳米纤维的双疏水 ELPs 在低于 1wt% 的浓度下就能形成物理水凝胶，而通常物理交联的 ELP 水凝胶需要较高的多肽浓度（>5wt%）。动态流变测量显示，极低浓度（0.034wt%）的 GPG 纳米纤维分散液在很宽的角频率范围内表现出类似固体的行为，储能模量 G’大于损耗模量 G” ，这归因于形成了高长径比（>500）的纳米纤维，在溶液中形成了渗透网络。当纳米纤维浓度增加到 0.2wt% 以上时，水凝胶失去明显的流动性，G’随浓度增加而增大。GPG 水凝胶无论是否带有末端 RGD 序列，都表现出相似的机械性能，可在保持相同机械性能的同时改变其生物活性。这种水凝胶还具有可逆的溶胶 - 凝胶转变特性，摇晃时液化，静置后恢复凝胶状态。对含有 0.5wt% GPG - RGD 的凝胶施加循环应变，当施加 100% 应变（γ=100%）时，G’和 G” 的相对关系反转，粘性超过弹性；当γ=0.5%时，G’>G” ，弹性恢复。这表明施加较大应变时，纳米纤维的物理交联点解离，水凝胶变为粘性；去除应变后，纤维再次形成交联点，恢复弹性。这种自愈合特性可用于创建三维细胞培养系统，通过温和的移液操作就能嵌入和回收细胞，目前相关的三维细胞培养研究正在进行中。

结论与展望

原弹性蛋白和 ELPs 是呈现 LCST 型 LLPS 并形成凝聚层的代表性聚合物。尽管自 20 世纪 70 年代就已知它们能形成凝聚层，但近年来在其分子机制和动力学研究方面取得了显著进展。简单 VPGXG 重复序列的 ELPs 相转变行为虽被认为可逆，但更接近原弹性蛋白的合成蛋白凝聚层会发生不可逆成熟。双疏水 ELPs 可通过凝聚作用和分子重排形成各向异性纳米纤维，通过结合功能性肽基序可定制纳米纤维的生物学功能，带有 REDV 肽基序的纳米纤维作为小直径血管移植物的组件极具前景。纳米纤维分散液具有物理交联水凝胶的特性，能响应剪切应力发生可逆的溶胶 - 凝胶转变，其粘弹性使其适用于多种应用，如三维细胞培养底物、可注射凝胶和三维生物打印的生物墨水等。

展望未来，研究人员计划从两个方向展开研究：一是制备管状小直径血管移植物，并按照 ISO7198 标准评估其机械性能，若能获得与自体血管相似的机械性能，将进入动物模型的临床前研究；二是使用双疏水 ELP 水凝胶作为三维细胞培养底物，系统研究水凝胶的机械性能和功能性肽基序比例对细胞增殖和分化的影响，这些基础研究结果将有助于为未来再生医学应用设计合适的水凝胶提供指导。}