病毒诱导基因沉默（VIGS）新突破：优化载体助力长寿命植物研究

《Journal of Virology 4.0》：Hairpin inserts in viral genomes are stable when they conform to the thermodynamic properties of viral RNA substructures

本文发现通过模拟病毒基因组热力学特性，可稳定 VIGS 载体插入序列，为长寿命植物研究开辟新途径。

　　

引言

病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是一种利用植物自身抗病毒防御机制 —— 转录后基因沉默来抑制靶基因表达的技术。在 VIGS 过程中，通常会对正链 RNA 病毒进行工程改造，使其携带一段与靶 mRNA 互补的 RNA 序列，并将其插入到病毒基因组中不参与关键功能（如复制、翻译和运动）的区域。当 VIGS 载体感染植物细胞后，病毒基因组的高度结构化区域会被类切酶（Dicer-like endonucleases，DCLs）切割，产生病毒特异性的 21 - 24 nt 病毒小干扰 RNA（viral siRNAs，vsiRNAs）。vsiRNAs 会被整合到 RNA 诱导沉默复合体中，在 Argonaute 蛋白的作用下，与特定的靶 RNA 杂交，从而诱导序列特异性的降解或翻译抑制。此外，宿主的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 6（RNA-dependent RNA polymerase 6，RdRp6）还能通过转录生成完全双链的病毒 RNA，这些 RNA 再被 DCLs 加工成额外的 vsiRNAs，并运输到整个植物体内。

自烟草花叶病毒 VIGS 载体首次成功沉默烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的八氢番茄红素去饱和酶（Phytoene desaturase，PDS）基因以来，已有超过 50 种 RNA、DNA 和卫星 RNA 病毒被改造成 VIGS 载体，用于多种植物的基因沉默研究。VIGS 技术能够快速诱导表型变化，在功能基因组学研究、阐明植物对生物和非生物胁迫的防御机制方面具有重要意义。若其症状轻微且传播可忽略不计，还可成为农业发展的重要工具，如控制病原体、改变田间作物和长寿命树木及藤蔓的性状等。然而，VIGS 技术在农业应用中受到了限制，主要原因是插入的外源 RNA 序列会迅速缺失。

此前研究认为，外源序列的丢失可能是由于有毒序列、插入片段长度或不合适的插入位点导致病毒适应性降低，也有观点认为是病毒 RdRp 重组导致插入序列被去除。虽然有研究尝试通过计算机预测单链插入位点或减小插入片段大小来稳定 VIGS 载体，但这些方法只能实现部分插入片段的保留，无法满足长寿命农业植物的应用需求。

病毒 RNA 基因组会折叠形成多种亚结构。有理论认为，RNA 亚结构的高可塑性不利于病毒生存，进化会使其降低可塑性，以减少热波动下 RNA 亚结构的构象数量，使最有利的结构占主导地位，从而提高病毒适应性。基于此，本文推测了解病毒内源性 RNA 亚结构的热力学特性，并将这些特性应用于 VIGS 载体插入的外源 RNA 序列中，可能会提高插入序列的保留率。

本研究选择了柑橘黄脉相关病毒（Citrus yellow vein-associated virus，CY1）进行研究。CY1 是一种正链 RNA 病毒，其基因组包含两个开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs），分别编码 21 kDa 的复制相关蛋白和 81 kDa 的 RdRp。CY1 的独特之处在于它不编码运动蛋白和衣壳蛋白，却能利用宿主的 RNA 运动蛋白系统感染多种柑橘和非柑橘宿主的维管组织。此外，CY1 具有广泛的 3?非翻译区（3?UTR），且其基因组 RNA 二级结构已被完全绘制，许多重要功能元件的位置也已明确，这些特点使 CY1 成为研究 VIGS 载体稳定性的理想对象。

结果

1. 确定 CY1 中可容纳插入的位点：将 CY1 转化为 VIGS 载体的第一步是确定能够接受外源序列且不影响病毒重要功能的插入位点。CY1 基因组的二级结构分为三个结构域，为避免破坏 RdRp 编码区域，插入位点需选在 3?UTR 内。研究人员评估了多个可能的插入位点，最终选择了位于结构域 2 和 3 中的一些单链内部和顶端环区域，包括 2250、2301、2304、2319、2330 和 2426 等位置。在这些位置插入不同基因编码区的片段后，通过小麦胚芽提取物（Wheat Germ Extract，WGE）评估 p21 和 p81 的翻译效率，并在烟草本氏烟植株中评估病毒的系统运动能力。结果发现，在结构域 2 插入序列的病毒转录本与亲本 CY1 产生相似水平的 p21 和 p81，而在结构域 3 的 2426 位置插入序列会显著降低 p21 和 p81 的翻译。进一步研究发现，只有在结构域 2 的所有位点插入最短片段（PDS60，60 nt）的 CY1 感染的植株，在接种 3 周后（3 weeks post-infiltration，3 wpi）出现典型的 CY1 早期症状，如植株矮化和顶叶卷曲。基于此，研究人员选择 2304 位置进一步研究发夹结构的稳定性。
2. PDS60 插入 CY1 后增加了插入区域的 RNA 可塑性且未被保留：研究人员使用靶向 PDS mRNA 的插入片段，因为有效的 VIGS 活动会导致植物叶片光漂白。然而，感染携带 PDS60 的 CY1 的植株均未表现出沉默表型。对感染植株的 RNA 进行逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）分析发现，插入的 PDS60 序列发生了缺失。通过分析 RNA 可塑性的两个关键决定因素 —— 结构位置熵（Positional Entropy，PE）和最小自由能（Minimal Free Energy，MFE，也称为吉布斯自由能 ΔG），研究人员发现，PDS60 插入后，插入区域的平均 PE（Average PE，APE）增加，而在插入序列部分缺失后，APE 降低，这表明区域 APE 的降低可能与病毒适应性增强有关。
3. 插入低 PE 发夹靶向绿色荧光蛋白（GFP）可诱导有效沉默但未被保留：设计了一个具有低 APE 的 66 nt 发夹（GFP66），用于靶向转基因烟草本氏烟 16c 中表达的 GFP mRNA。将 GFP66 插入 CY1 的 2301 位置后，在接种 2 周时，部分植株的上部系统叶出现 GFP 沉默现象，且沉默现象持续至植株衰老。但 RT-PCR 分析发现，在接种 3 周时，病毒群体中出现了大量缺失变异体，这表明即使是具有低 APE 的完全碱基配对发夹，插入 CY1 后也不能被有效保留，说明低 APE 不足以维持插入序列的稳定性。研究人员还将 GFP66 插入其他位点进行测试，结果发现 GFP66 在所有测试位点均未被完全保留，且当 GFP66 插入天然发夹 H4 的顶端环（2250 位置）时，部分后代出现了插入序列和大部分天然发夹的缺失。此外，研究人员评估了其他几个低 APE 发夹的保留情况，发现除了 PDS51 外，其他发夹均未被保留。PDS51 和类似大小的 GFP52 具有相似的低 APE，但它们的预测 ΔG 值相差 8.2%，这表明 ΔG 可能对发夹的维持很重要。
4. CY1 天然发夹复制并用作插入片段时是稳定的：为验证病毒基因组进化使得 RNA 亚结构具有精确调节的热力学特性这一假设，研究人员选择了四个天然 CY1 发夹（H1、H2、H3 和 H4）进行复制，并将其插入到 CY1 基因组的不同结构域 2 位点。结果发现，这些天然发夹插入后，在接种 3 周和 13 周时，RT-PCR 产物均为单一条带，且与亲本构建体的 PCR 产物共迁移。对最大插入片段 H1_2219ΔH4的 RT-PCR 产物进行测序，发现插入序列在 13 周内未发生变化。进一步克隆和测序 H1_2219ΔH4的 RT-PCR 产物，结果表明所有克隆均保留了与亲本构建体相同的序列。这强烈表明，若插入 CY1 基因组的发夹具有进化的天然发夹的构象和 / 或热力学特性，则可能被保留。研究人员还比较了野生型 CY1 和 H1_2219ΔH4感染植株的症状出现时间，发现两者相似，这表明 H1_2219ΔH4与野生型 CY1 的复制能力相似，尽管它含有额外的 138 nt 序列。通过分析天然 CY1 发夹的 ΔG 与发夹长度的关系，研究人员发现两者呈线性相关，且未被保留的人工发夹的 ΔG / 发夹长度比天然发夹更负，而保留良好的 PDS51 的 ΔG 值仅比未保留的 GFP52 高 8.2%，这表明即使 ΔG 的微小差异也可能影响发夹的维持。
5. 改变 GFP59 和 GFP66 以模拟天然发夹 H4 的结构和热力学特性后在 CY1 载体中得以维持：根据天然发夹复制插入实验结果，研究人员推测设计具有与天然 CY1 发夹相似特性的发夹可能实现稳定插入。于是，他们对未被有效保留的 GFP59 和 GFP66 进行改造，使其 3?端结构类似于 H4。改造后的 GFP59m 和 GFP61m 分别插入 CY1 基因组的 2304 和 2219ΔH4 位置。结果发现，GFP59m 和 GFP61m 在接种 3 周时均能稳定存在，RT-PCR 产物与亲本构建体共迁移，且测序结果表明插入发夹完整。而改造后热力学稳定性更高的 GFP63m 在插入 2219ΔH4 位置后，虽然最初似乎能维持，但测序发现只有 33 nt 被保留，这表明模拟天然 CY1 发夹的结构并使 ΔG / 发夹长度与天然发夹相似或更高，有助于外源序列的保留。
6. 设计的相似大小发夹在 CY1 载体中表现出与预测相符的表型：根据天然 CY1 发夹的 ΔG 与发夹长度的线性关系，研究人员计算出一个 160 nt 发夹若要在 CY1 中被保留，其 ΔG 应约为 - 70 kcals/mol。基于此，他们设计了三个 159 - 160 nt 的发夹（Ftsz159、Ftszrc160 和 Ftsz160），其中 Ftsz159 和 Ftszrc160 的 ΔG 符合预测，Ftsz160 的 ΔG 更负。将这三个发夹插入 CY1 的 2219ΔH4 位置后，RT-PCR 分析结果显示，在接种 3 周和 10 周时，Ftsz159_2219ΔΗ4和 Ftszrc160_2219ΔΗ4的 RT-PCR 产物为单一条带，与亲本构建体大小一致，表明这两个发夹被很好地维持；而 Ftsz160 的 RT-PCR 产物出现两条带，其中较低的条带仅包含原始发夹的 32 nt，说明其未被有效保留。这些结果进一步支持了 ΔG / 长度在设计可在 CY1 VIGS 载体中稳定存在的发夹中的重要性。
7. ΔG 和 PE 分布对 CY1 中发夹维持均很重要：此前研究中检测的发夹均具有较低的 APE，为探究低 APE 对发夹设计的重要性，研究人员设计了两个具有适当 ΔG 值但顶端区域 PE 值较高的发夹 SF60 和 FS66。将 SF60 插入 2301 位置，FS66 插入 2219ΔH4 位置，接种 3 周后进行 RT-PCR 分析，结果发现这两个发夹均未被维持，且测序结果显示缺失发生在高 PE 区域，这表明在发夹中维持低 APE 以及合适的 ΔG 对于发夹插入 CY1 后的维持至关重要。
8. 设计的具有适当热力学特性的发夹在柑橘中至少保留 30 个月：在烟草本氏烟中，具有适当热力学特性的发夹可在至少 13 周内保持稳定，为评估其在长寿命植物中的长期稳定性，研究人员将一个模拟 H4 的 61 nt 发夹（6.2m61）插入 CY1 的 2219ΔH4 位置，并将构建体浸润到 1 年生的墨西哥酸橙树中。在接种 30 个月后，对两棵树的两个位置采集的 RNA 样本进行 RT-PCR 分析，结果显示扩增产物与亲本构建体共迁移，测序未检测到变异体。为进一步确定插入发夹在新植株中的稳定性，研究人员将感染野生型 CY1 和 6.2m61_2219ΔH4的树的接穗嫁接到五棵新的墨西哥酸橙树上，并在嫁接 12 个月后进行检测。结果发现，五棵树中有四棵在 42 个月的联合感染时间内维持了 6.2m61 的插入，只有一棵树中的病毒出现了大部分插入序列的缺失，这表明可能还需要探索其他参数（如消除大的内部凸起）以确保更长时间的稳定性。总体而言，这些结果支持了研究人员的假设，即具有与天然发夹匹配的热力学特性的发夹亚结构可在正链 RNA 病毒基因组中长期维持，为 VIGS 在长寿命田间作物中的应用开辟了道路。

讨论

VIGS 技术在植物功能基因组学研究中应用已久，但由于插入病毒基因组的序列不稳定，其在农业领域，尤其是长寿命树木和藤蔓中的应用受到严重阻碍。在 CY1 中插入短序列和简单发夹的初始实验大多失败，只有少数例外。基于 Ancel 和 Fontana 的理论，研究人员提出了一个假设，即 RNA 病毒基因组进化出了降低可塑性的特性，以最小化对功能效率的损害。因此，若简单发夹插入片段的热力学特性与植物病毒基因组相兼容，那么它们可能会被保留。

实验结果支持了这一假设。例如，低 APE 的发夹 GFP66、GFP52、GFP59 和 Cal7-66 保留效果不佳，而热力学稳定性较低的 PDS51 却能在 3 周内被维持，这表明 CY1 VIGS 载体对发夹插入片段的保留可能需要特定的热力学特性，包括合适的 ΔG 值。四个天然 CY1 发夹作为插入片段时能长期保留，且 ΔG 与发夹长度呈线性关系，这也支持了该假设。此外，通过改造非保留发夹 GFP66 和 GFP59，使其模拟天然发夹 H4 的构象和 ΔG / 长度，可使它们在 CY1 中至少保留 3 周；设计具有适当 ΔG / 长度的 160 nt 发夹也能被有效保留，这表明精确模拟天然发夹的构象并非必要，合适的 ΔG / 长度更为关键。

研究还发现维持低 APE 对插入片段的保留很重要。插入低结构的 PDS60 会显著提高插入位点附近的 APE，同时伴随二级结构的构象变化，而随后发生的缺失会降低局部 APE 并使结构更接近原始状态；插入顶端区域具有高 APE 的发夹 SF60 和 FS66 会导致高 PE 区域被选择性删除，这些都表明将与天然 CY1 RNA 亚结构对应的热力学特征纳入发夹设计中，有助于插入片段在 VIGS 载体中的维持。

对 CY1 基因组二级结构的分析表明，其他参数可能也对发夹插入设计很重要。CY1 亚结构的连续碱基对区域相对较短，且基因组中存在许多短的非配对区域，这种结构特点可能使基因组保持适度的结构可塑性，既不过高也不过低。同时，这种结构可能有助于减少抗病毒防御机制对双链 RNA 的识别，因为 DCL 内切酶会切割双链 RNA，而大的单链 RNA 区域可能更容易成为 RNA 诱导沉默复合体（RNA-induced Silencing Complex，RISC）的靶标。因此，CY1 发夹的热力学趋势可能并非直接有助于稳定性，而是使发夹具有抵抗宿主抗病毒机制的特性。

通过随机生成大量不同长度、核酸组成和互补性的发夹，研究人员发现 CY1 发夹的 ΔG 与长度的关系主要由发夹内的碱基对数量驱动。CY1 发夹与随机生成的 50% - 60% 互补性的发夹最为相似，这进一步支持了 CY1 中 ΔG 与长度的关系是配对和非配对区域平衡的结果。此外，研究还发现这种 ΔG / 长度关系可能也适用于其他正链 RNA 病毒，但不适用于一般的大 RNA 结构。例如，番茄丛生矮缩病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）的发夹与 CY1 的 ΔG 与长度关系相似，而核糖体 RNA 的发夹具有更高的互补性和更稳定的结构，植物 mRNA 和 DNA 病毒转录本的发夹则与低互补性的随机生成发夹相似。

插入片段若具有不可接受的热力学特性（高 APE 和低 ΔG / 长度）可能会被快速删除，一种可能的解释是这些特性会在 CY1 基因组中产生 RdRp 重组热点。重组热点通常与茎环结构相邻或位于碱基配对概率低的非结构化区域。低 ΔG / 低可塑性区域可能导致聚合酶暂停，促进 RNA 模板的提前释放。若 RdRp 与截断的新生链保持结合，它可以在同一或不同模板的第二个位置重新开始转录。若重新开始的位点靠近初始释放位点，就会发生局部缺失，这与 GFP52、GFP59、GFP66 和 Cal7-66 插入时的观察结果一致。目前<