攻克细菌遗传改造难题：靶向防御岛解锁希瓦氏菌应用潜力

《Applied and Environmental Microbiology》：Efficient genetic manipulation of Shewanella through targeting defense islands

本文系统研究希瓦氏菌防御岛，发现敲除相关岛屿可提升遗传操作效率，助力其生物技术应用。

　　

引言

希瓦氏菌（Shewanella）以其在厌氧环境中卓越的呼吸适应性而闻名。这类细菌能利用多种有机和无机化合物作为末端电子受体，在生物地球化学循环中发挥关键作用。例如，它们可在厌氧条件下还原铁离子（Fe (III)）和锰离子（Mn (IV)），这一特性使其在重金属污染生物修复及微生物燃料电池等领域展现出巨大潜力。

在希瓦氏菌众多研究对象中，腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是异化铁还原的模式生物。像 CN32、W3 - 18 - 1 等不同菌株，从厌氧页岩砂岩到深海沉积物等多样环境中被分离出来，其独特的呼吸灵活性吸引了众多科研人员关注，相关研究聚焦于信号转导途径、生理学和代谢调控等方面。

然而，对希瓦氏菌进行遗传工程改造以进一步挖掘其潜力时，却面临着重重阻碍。细菌自身存在的防御机制，如限制修饰（RM）系统和簇状规律间隔短回文重复（CRISPR）系统，会对导入的外源 DNA 产生排斥，严重影响遗传修饰的效率。此前虽有研究通过删除部分防御系统，如敲除S. putrefaciens W3 - 18 - 1 中的 PstI/PstM 系统来提升遗传可操作性，但许多细菌拥有多种未被充分研究的防御机制，使得传统策略效果受限。研究发现，多个防御系统常聚集在防御岛上，因此，靶向去除这些防御岛或许是提高细菌遗传操作效率的更优途径。

结果

1. CN32 中整合在编码多种防御系统基因上的基因组岛被发现：S. putrefaciens CN32 基因组大小为 4659kb，包含约 3972 个开放阅读框（ORFs）。利用 DefenseFinder 工具，研究人员在 CN32 中鉴定出 17 种防御系统，涵盖 RM 系统、dGTPase、CRISPR/Cas 系统等多种类型。通过对 CN32 与相关物种（如S. putrefaciens W3 - 18 - 1 和Shewanella sp. ANA - 3）染色体的比较分析，发现了三个特殊的基因组岛：CGI48、GI_trmA和 MGI_trmE。
   • CGI48 是一个复合基因组岛，携带一个 21kb 的基因组岛（GI21），包含编码 RM_Type_I 和 RM_Type_IV 的基因。
   • GI_trmA整合在trmA基因内，该基因负责编码 tRNA（尿苷 (54)-C5）- 甲基转移酶。GI_trmA长度为 31561bp，编码 RM_Type_I、Kiwa 和 DarTG 三种防御系统，而 W3 - 18 - 1 和 ANA - 3 的trmA基因中不存在此类整合的基因组岛。
   • MGI_trmE插入在trmE基因内，trmE基因编码 tRNA 修饰 GTPase。MGI_trmE长 30569bp，编码 RM_Type_I 系统、RolC 蛋白以及五种与钴 - 锌 - 镉抗性相关的蛋白。W3 - 18 - 1 的trmE基因中有一个 SGI1 样基因组岛（SGI1Sp），ANA - 3 则没有，且 MGI_trmE编码的与 MobI (A/C) 同源的结合转移蛋白，在 IncC 质粒存在时参与基因组岛的转移。
2. GI_trmA和 MGI_trmE可从 CN32 染色体上切除：序列分析显示，GI_trmA和 MGI_trmE中分别存在切除酶 Sputcn32_3522（Xis₃₅₂₂）和 Sputcn32_3991（Xis₃₉₉₁），它们与原噬菌体 CP4 - 57 调节蛋白的 AlpA 家族切除酶具有保守结构域。实验表明，过表达 Xis₃₅₂₂使 GI_trmA的切除率提高了 1.1×103 倍，达到 6.0%；过表达 Xis₃₉₉₁使 MGI_trmE的切除率提高了 3.0×10?倍，达到 20.8%。
   • 此前研究发现宿主类核结构蛋白（H - NS）可调节希瓦氏菌中某些移动遗传元件的切除。但在 CN32 中，研究人员利用hns缺失突变体进行实验，结果显示删除hns基因对 GI_trmA和 MGI_trmE的切除率没有显著影响，表明 H - NS 在 CN32 中不参与调节这两个基因组岛的切除。
3. 基因组岛缺失突变体 ΔGI_trmA和 ΔMGI_trmE的构建：为探究 GI_trmA和 MGI_trmE在宿主细菌中的作用，研究人员尝试构建它们的缺失突变体。利用基于切除酶的方法，通过在 CN32 中过表达 Xis₃₅₂₂和 Xis₃₉₉₁来构建 ΔGI_trmA和 ΔMGI_trmE突变体。结果发现，过表达 Xis₃₉₉₁可顺利获得 ΔMGI_trmE突变体，但过表达 Xis₃₅₂₂时，获取 ΔGI_trmA突变体却遇到困难。
   • 研究人员推测，这可能与 GI_trmA中编码的毒素 - 抗毒素（TA）系统有关。TA 系统由毒素和抗毒素组成，毒素对细菌细胞有毒性，抗毒素可中和其毒性。TA 系统通过一种称为 “后分离杀伤”（PSK）的机制稳定基因组岛或原噬菌体，即杀死丢失相关元件的细胞，使细菌群体对这些元件产生 “依赖”。
   • 研究人员对 GI_trmA中推测的 TA 系统 Sputcn32_3515 - Sputcn32_3514 进行功能验证。序列分析表明，Sputcn32_3515（CopG₃₂）编码的转录调节因子与 CopAso 有 92% 的同一性，Sputcn32_3514（ParE₃₂）编码的蛋白与 ParEso 有 99% 的同一性。将这两个基因克隆到基于 pCA24N 的质粒中，并在E. coli BW25113 细胞中进行表达测试，结果显示过表达 ParE₃₂会诱导细胞毒性，而 CopG₃₂无毒性且能有效抵消 ParE₃₂的毒性，证实了 ParE₃₂和 CopG₃₂构成一个功能性 TA 系统，ParE₃₂有助于维持 GI_trmA切除后的稳定性，从而阻碍 ΔGI_trmA突变体的产生。
   • 基于上述发现，研究人员敲除了 GI_trmA中的毒素基因parE₃₂，构建出 Δ*parE₃₂* 菌株。在该菌株中过表达切除酶 Xis₃₅₂₂，成功获得了 ΔGI_trmA突变体，这表明 ParE₃₂/CopG₃₂ TA 系统在维持 GI_trmA切除后的稳定性方面起着关键作用，使得在该 TA 系统存在时，构建 GI_trmA敲除突变体的难度增加。
4. GI_trmA和 MGI_trmE有助于细菌宿主抵御噬菌体和质粒：为评估 GI_trmA和 MGI_trmE中预测的防御系统对噬菌体的防御功能，研究人员将相关系统克隆到模式生物E. coli BW25113 中进行测试。在 GI_trmA中，一个包含 Type I RM、KwaAB 和 DarTG 系统（Sputcn32_3523 - 3529）的 9.9kb DNA 片段被发现共转录，提示其为一个功能单元；在 MGI_trmE中，一个包含 Type I RM 系统和 RolC（Sputcn32_3981 - 3587）的 12.3kb DNA 片段也共转录。将这两个片段分别克隆到质粒载体 pBBR1Cm 中，并导入E. coli BW25113，构建出 BW25113/pGI_trmADs 和 BW25113/pMGI_trmEDs 工程菌。
   • 用多种噬菌体（包括来自Siphoviridae、Myoviridae和Podoviridae家族的有尾双链 DNA 噬菌体 T1、T5、EEP、T4 和 T7）感染这些工程菌，通过比较含防御系统的细菌与对照细胞上噬菌体的平板效率（EOP），发现 pGI_trmADs 和 pMGI_trmEDs 对 T1、EEP、T4 和 T7 四种噬菌体有显著防御作用，但对 T5 噬菌体无效。pGI_trmADs 使 T1、EEP 和 T7 噬菌体的产量比对照细胞降低了 10 - 70 倍，pMGI_trmEDs 使其降低了 100 - 1000 倍，两者对 T4 噬菌体产量的降低幅度更是高达 10?倍，表明 GI_trmA和 MGI_trmE作为防御岛，增强了宿主细菌对多种噬菌体的防御能力。
   • 在质粒转移限制方面，研究人员测试了四种不同用途的质粒：用于组成型表达靶基因的 pBBR1Cm、用于蛋白过表达的 pMMB207（含 Tac 启动子）、用于通过 Cas9 进行基因敲除的 pMBLCas9 以及用于插入诱变的转座子递送质粒 pSC189。以E. coli WM3064 为供体菌株，ΔGI_trmA、ΔMGI_trmE和 ΔCGI48 为受体菌株，野生型 CN32 为对照进行结合实验，计算转移效率（转导子与受体细胞的比例）。
   • 结果显示，删除 GI_trmA或 MGI_trmE可使 pBBR1Cm 的转移效率分别提高 10? - 10?倍，达到 5.8×10?3 或 9.6×10??转导子 / 受体细胞，而删除 CGI48 对 pBBR1Cm 的转移效率无显著影响。对于 pMMB207 质粒，删除 GI_trmA使其转移效率提高 1.4×102 倍，达到 8.7×10??转导子 / 受体细胞，删除 MGI_trmE使其提高 38 倍，达到 2.3×10??转导子 / 受体细胞，删除 CGI48 同样无显著影响。对于用于基因敲除的 pMBLCas9，删除 GI_trmA或 MGI_trmE可使其转移效率提高 103 倍，达到 10??转导子 / 受体细胞，而野生型 CN32 和 ΔCGI48 中未检测到转导子。对于 pSC189，删除 GI_trmA使其转移效率提高 1.9×103 倍，达到 1.9×10??转导子 / 受体细胞，显著高于删除 MGI_trmE后的效率（6.2×10??）。
   • 研究人员还构建了同时缺失 GI_trmA和 MGI_trmE的菌株（ΔGI_trmA + MGI_trmE），发现四种质粒向该菌株的结合效率均高于向 ΔMGI_trmE菌株的效率，但与向 ΔGI_trmA菌株的转移效率相比，无显著倍数差异，表明 GI_trmA和 MGI_trmE均参与抵御外源质粒，且 GI_trmA的防御能力更强，但同时删除这两个系统不会使 CN32 菌株的质粒转移效率产生协同增强效应。
5. GI_trmA和 MGI_trmE中的防御系统在革兰氏阴性菌中广泛分布：利用 BLASTN 在 NCBI 数据库中搜索 GI_trmADs 和 MGI_trmEDs 的同源物，以探究这些防御系统的分布情况。结果发现，基于核苷酸序列（≥40% 覆盖度和≥70% 同一性），共鉴定出 19 个 GI_trmADs 同源物，其中 4 个在希瓦氏菌属，7 个在交替单胞菌属，4 个在变形杆菌属，还有一些在海洋单胞菌属、弧菌属、哈氏菌属和假交替单胞菌属的菌株中。进一步分析发现，S. putrefaciens菌株 FDAARGOS_681 的一个基因组岛上的 GI_trmADs 同源物与 GI_trmA的同一性达 100%，且有 10 个同源物位于整合在yicC基因位点的基因组岛上。
   • 同样，基于核苷酸序列（≥60% 覆盖度和≥80% 同一性）鉴定出 12 个 MGI_trmEDs 同源物，其中 6 个在希瓦氏菌属，其他分布在假交替单胞菌属、海洋单胞菌属、弧菌属和交替单胞菌属的菌株中。这些同源物中，5 个位于整合在trmE基因的基因组岛上，4 个在整合在yicC基因的基因组岛上，还有一些预测位于整合在ssrA基因和 tRNA^Val的基因组岛上。S. putrefaciens菌株 FDAARGOS_681 同时含有与 GI_trmA和 MGI_trmE同一性为 100% 的基因组岛，S. putrefaciens 4H 菌株则含有与 MGI_trmEDs 同一性为 100% 的基因组岛以及与 GI_trmADs 同一性为 96% 的防御系统，不过其 GI_trmADs 所在的基因组岛整合在yicC基因而非trmA基因上。这表明 GI_trmA和 MGI_trmE中的防御系统在革兰氏阴性菌中广泛分布，它们作为 “货物基因”，与不同整合位点的各种基因组岛相结合。

讨论

对细菌进行遗传改造对提升其工业应用价值至关重要，比如在代谢产物生产和提高生长速率等方面。然而，细菌的防御机制，如 RM 系统和 CRISPR 系统，给遗传操作带来了巨大挑战，它们像坚固的屏障一样阻挡着外源 DNA 的进入，使期望的遗传修饰难以实现。为了克服这些障碍，科研人员开发了多种策略。例如，体外甲基化质粒 DNA 可避免被 RM 系统识别；敲除或抑制特定的 RM 和 CRISPR 位点也能有效消除部分障碍；噬菌体来源的抗 CRISPR 蛋白则可暂时抑制 CRISPR 系统，提高遗传操作效率。这些方法在部分遗传改造困难的细菌物种中取得了一定成效，尤其是在 RM 和 CRISPR 系统已被充分研究的情况下。但许多细菌存在多种未被鉴定和研究的防御机制，使得遗传操作的难度依然很大。

本研究提出了一种全新的策略，即靶向细菌基因组中的防御岛，以S. putrefaciens CN32 为研究对象展开深入探究。该策略包含三个关键步骤：首先利用公共数据库预测防御系统；接着将这些系统定位到细菌基因组中，并预测相关基因组岛的边界；最后对鉴定出<