添加草药制剂对湖羊瘤胃微生物及代谢影响的研究进展

《mSphere 3.7》：Integrated multi-omics to elucidate the interplay between rumen microorganisms and host metabolism in Hu sheep supplemented with herbal preparations

本文通过实验揭示了草药制剂对湖羊瘤胃微生物、代谢物的影响及其相互关系。

　　

引言

反刍动物主要依靠瘤胃进行食物消化，瘤胃微生物群落对于营养代谢、吸收以及肠道相关免疫功能至关重要。瘤胃微生物能将饲料中的碳水化合物、蛋白质和脂肪发酵成动物可利用的能量形式，还能分解哺乳动物难以消化的纤维等有机化合物，合成非蛋白氮，其产生的挥发性脂肪酸可为反刍动物提供 70% 的日常能量需求 。因此，了解瘤胃微生物群落的组成和功能，对提高反刍动物的消化效率和生产性能意义重大。

瘤胃微生物的组成影响反刍动物的消化代谢以及代谢物含量的变化。瘤胃液中的代谢物在生物代谢、宿主生长、营养利用和整体健康状况中发挥关键作用，血液中的代谢物对动物的生长发育也至关重要。研究表明，瘤胃微生物代谢物和血清代谢物对牛奶产量（MPY）的影响超过瘤胃微生物组成和功能。色氨酸（Tryptophan）的代谢产物可改善瘤胃功能，提高瘤胃发酵效率和微生物组成 。同时，瘤胃微生物群与宿主代谢组共同影响奶牛的甲烷排放和饲料效率。临床研究还发现，大量 D - 葡萄糖从瘤胃内容物直接转运到血液中，说明瘤胃内容物代谢与血清代谢存在相关性。

草药制剂作为饲料添加剂在畜牧业中应用广泛，在改善动物健康、增强免疫力、提高消化效率和促进生长方面具有独特优势。中药（如 Sauce llorón 提取物）有望替代抗生素，提高动物生产性能和瘤胃功能。给肉牛饲喂 20g/kg 的草药制剂，不仅能提高平均日增重，还能提升消化酶活性和整体消化率。黄芪根补充剂可增加藏羊的平均日增重，黄芪多糖（Astragalus polysaccharides）能改善畜禽的生长性能和肠道发育。然而，关于中药制剂添加后瘤胃微生物、瘤胃内容物和血清中独特的代谢物及相关代谢通路的研究较少，瘤胃微生物群、瘤胃代谢组和宿主血清代谢组之间的相关性也有待探索。本研究旨在探究添加草药制剂后湖羊瘤胃微生物与瘤胃及血清代谢之间的相互作用。

材料与方法

本实验在甘肃省武威市古浪县龙琴现代农业畜牧产业有限公司进行，时间为 2023 年 3 月至 6 月。中药配方主要由 11 种传统中药成分组成，包括党参（26%）、神曲（20%）、麦芽（13%）、炒山楂（13%）、黄芪（4%）、茯苓（4%）、白术（4%）、豆蔻（4%）、陈皮（4%）、扁豆（4%）和五味子（4%）。其营养成分包括粗蛋白（CP）11.84%、灰分 11.17%、中性洗涤纤维（NDF）23.69%、酸性洗涤纤维（ADF）11.26%、钙 0.97%、磷 1.94%，有效活性成分有水提取物粗提物 33.86%、总多糖 27.21%、总黄酮 0.36% 。实验动物和饲料由该公司提供。基础日粮由玉米（40%）、棉粕（5.5%）、豆粕（12.5%）、花生秧（29%）、麸皮（9%）等组成，营养水平为代谢能（ME）8.57、CP 14.51、乙醚提取物（EE）2.21、NDF 30.11、ADF 19.58、钙 1.01、磷 0.47。

实验采用单因素随机设计，选取 3 月龄、平均初始体重为（19.57 ± 1.56 kg）的雄性湖羊羔羊，随机分为三组，每组 6 只。对照组（Con）饲喂基础日粮；试验一组（Test I，T1）在精料中添加 0.5% 草药制剂；试验二组（Test II，T2）在精料中添加 1% 草药制剂。实验共 100 天，包括 10 天预实验期和 90 天正式实验期。实验前，湖羊按规定免疫，圈舍彻底清洁消毒，实验期间羊可自由采食和饮水。

在饲养试验最后一天清晨，空腹采集试验羊血液样本，从颈静脉采血至促凝管，血清在 4°C 孵育 30 分钟，1500 rpm 离心 10 分钟，所得血清转移至冻存管，-80°C 保存，用于血清代谢组分析。饲养试验结束后，所有试验羔羊禁食 12 小时后安乐死，从每只羔羊提取 10 mL 瘤胃内容物，分装入三个无菌冻存管，液氮速冻后 - 80°C 保存，用于评估微生物多样性和代谢组学分析。

使用 TGuide S96 Magnetic Soil/Stool DNA Kit 提取瘤胃内容物基因组 DNA，用引物（27F: AGRGTTTGATYNTGGCTCAG; 1492R: TASGGHTACCTTGTTASGACTT）扩增 16S rRNA 基因的 V1~V9 高变区。扩增子定量后，标准化等摩尔浓度混合，在 PacBio Sequel II 平台测序。

血清和瘤胃内容物在冰上解冻，涡旋 10 秒。血清样本取 50 μL 与 300 μL 含内标的提取液（乙腈 [CH₃CN; ACN]: 甲醇 = 1:4, vol/vol）混合，涡旋 3 分钟，4°C 12000 rpm 离心 10 分钟，取 200 μL 上清。瘤胃内容物取 20 mg，加 400 μL 内标溶液（甲醇：水 = 7:3, vol/vol），涡旋 3 分钟、超声 10 分钟、冰浴涡旋 1 分钟，-20°C 静置 30 分钟，4°C 12000 rpm 离心 10 分钟，取 200 μL 上清用液相色谱 - 质谱仪（LC-MS）分析。

使用 USEARCH（版本 10.0）将相似度阈值大于 97% 的合格序列分配到操作分类单元（OTU）。基于 QIIME2 中的朴素贝叶斯分类器，以 SILVA 数据库（版本 138.1）对 OTUs/ASVs（扩增子序列变体）进行分类注释，置信阈值为 70% 。用 QIIME2 软件进行 Alpha 分析，Chao1 和 Ace 指数评估物种丰富度，Shannon 和 Simpson 指数衡量物种多样性。通过主坐标分析（PCoA）计算 Beta 多样性，评估样本间物种多样性，置换多元方差分析（PERMANOVA）评估不同组样本间 Beta 多样性差异的显著性。在正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）中，系数 R²X 量化模型对组间变异的解释比例，P<0.05 为差异有统计学意义。使用线性判别分析（LDA）结合效应大小值（LEfSe）评估差异丰度分类群。利用 PICRUSt2 构建进化树，预测未知物种基因信息，结合京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路预测群落水平通路。用 STAMP 中的 G-TEST 分析样本中功能层级 2 的功能丰度。

在 R 中使用 prcomp 函数进行无监督主成分分析（PCA），数据进行单位方差缩放（Z-score 标准化）。两组分析时，基于变量投影重要性（VIP）（VIP > 1）和 P 值（P<0.05，Student’s t 检验）确定差异代谢物。用 MetaboAnalystR 包生成 OPLS-DA 模型的得分图和置换图，数据进行 log₂转换和均值中心化，进行 200 次置换检验避免过拟合。用 KEGG Compound 数据库注释鉴定的代谢物，映射到 KEGG pathway 数据库，对显著调节的代谢物映射的通路进行代谢物集富集分析（MSEA），超几何检验确定富集显著性，P 值越接近 0 越显著。

结果

对 18 个瘤胃内容物样本测序，共获得 235,940 条 CCS（环形一致序列）序列，每个样本最少 12,003 条，平均 13,108 条。所有样本有效标签以 97% 一致性聚类，得到 1,710 个 OTU。对 OTU 代表性序列进行物种注释，共注释出 22 个门、33 个纲、64 个目、125 个科、248 个属和 389 个种。

基于瘤胃微生物 16S rRNA 基因测序结果的 Alpha 多样性分析显示，T1 和 T2 组的 ACE、Chao1、Shannon 和 Simpson 指数均显著低于 Con 组，表明草药制剂的添加降低了瘤胃微生物群落的丰富度和多样性。维恩图显示三组共有 1,710 个 OTU，其中 865 个为共享 OTU，Con 组有 176 个独特 OTU，T1 组有 112 个，T2 组有 78 个。基于 Bray-Curtis 相异度在 OTU 水平进行 PCoA 和 PERMANOVA 分析，结果显示 PC1 和 PC2 分别解释 53.73% 和 38.50% 的变异，Control、T1 和 T2 组间存在显著差异（R² = 0.992, P<0.05），表明草药制剂对羊瘤胃微生物组成影响显著。

在门水平，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）是湖羊瘤胃中的优势门。添加草药制剂后，T2 和 T1 组中 Firmicutes、变形菌门（Proteobacteria）和蓝细菌门（Cyanobacteria）的相对丰度高于 Con 组；Con 组中 Bacteroidota 和疣微菌门（Verrucomicrobiota）的相对丰度高于其他实验组，螺旋体门（Spirochaetota）在 T1 组相对丰度最高。在属水平，T1 和 T2 组中 Lachnospiraceae_NK3A20_group、NK4A214_group、Succiniclasticum 和 Christensenellaceae_R_7_group 的相对丰度高于 Con 组；Rikenellaceae_RC9_gut_group 相对丰度降低，Prevotella、Saccharofermentans 和 Ruminococcus spp. 在 T1 组相对丰度高于其他组。在种水平，添加草药制剂后，T1 和 T2 组中 Succiniclasticum_ruminis、unclassified Lachnospiraceae_NK3A20_group、rumen_bacterium_NK4A214 和 rumen_bacterium 的相对丰度高于 Con 组；rumen_bacterium_R_23 和 unclassified_Prevotella 相对丰度降低。LEfSe 分析显示，Con 组中 Bacteroidales、Bacteroidota、Rikenellaceae_RC9_gut_group 等相对丰度显著高于其他两组；T1 组中 Prevotella、rumen_bacterium 等 20 种细菌显著更丰富；T2 组中 Firmicutes、Christensenellaceae 等 12 种细菌显著更丰富（LDA > 4, P<0.05）。

PICRUSt2 结果表明，与 T1 和 T2 组相比，Con 组中与脂质代谢、萜类和聚酮化合物代谢以及全局和概述图谱相关的功能显著更丰富（P<0.05）。T1 组中其他氨基酸代谢、聚糖生物合成和代谢功能显著高于 Con 和 T2 组（P<0.05）。T2 组中细胞运动和信号转导功能显著高于 T1 和 Con 组（P<0.05），而能量代谢和其他次级代谢产物的生物合成显著低于其他两组（P<0.05）。在耐药性方面，Con 组中与抗菌和膜转运相关的功能显著低于其他实验组，T1 组抗菌功能显著高于 T2 组，T2 组膜转运功能显著高于 T1 组（P<0.05） 。

不同实验组瘤胃内容物样本显示出明显分离，PC1 和 PC2 分别解释 48.13% 和 22.94% 的方差，表明实验组间瘤胃代谢物存在显著差异，组内重复样本差异较小。OPLS-DA 分析显示各实验组聚类明显，组间差异显著，T1 vs Con、T2 vs Con 和 T2 vs T1 的 R²Y 值均为 1，Q²值分别为 0.987、0.995 和 0.992，模型拟合和预测性良好。根据 OPLS-DA 标准筛选差异代谢物，T1 vs Con 鉴定出 281 个（155 个上调，126 个下调），T2 vs Con 鉴定出 470 个（391 个上调，79 个下调），T2 vs T1 鉴定出 408 个（352 个上调，56 个下调）。差异代谢物主要包括氨基酸及其代谢物、核苷酸及其代谢物、有机酸及其衍生物、碳水化合物及其代谢物、脂肪酰基、辅酶和维生素等。热图分析显示，T1 和 T2 组中核苷酸及其代谢物、碳水化合物及其代谢物、有机酸及其衍生物、胆汁酸、杂环化合物、辅酶和维生素较 Con 组呈上升趋势；氨基酸及其衍生物和脂肪酰基因代谢物不同作用不同，添加草药制剂后氨基酸及其衍生物含量增加，0.5% 草药制剂添加后脂肪酰基含量总体呈增加趋势。

对瘤胃差异代谢物进行富集分析，T1 vs Con 差异代谢物主要富集在赖氨酸生物合成、D - 氨基酸代谢、蛋白质消化吸收等通路；T2 vs Con 主要富集在核苷酸代谢、亚油酸代谢、嘧啶代谢等通路；T2 vs T1 主要富集在嘧啶代谢、亚油酸代谢、核苷酸代谢等通路。

血清样本在不同实验组间明显分离，PC1 和 PC2 分别解释 27.89% 和 15.49% 的方差。OPLS-DA 分析显示各实验组聚类明显，组间差异显著，T1 vs Con、T2 vs Con 和 T2 vs T1 的 R²Y 值分别为 0.999、0.999 和 1，Q²值分别为 0.968、0.968 和 0.928，模型适合后续分析。T1 vs Con 鉴定出 365 个差异代谢物（209 个上调，156 个下调），T2 vs Con 鉴定出 362 个（183 个上调，179 个下调），T2 vs T1 鉴定出 268 个（113 个上调，155 个下调）。差异代谢物主要包括氨基酸及其代谢物、核苷酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、碳水化合物及其代谢物、脂肪酰基等。热图分析显示，T1 和 T2 组中碳水化合物及其代谢物、脂肪酰基、胆汁酸等较 Con 组呈下降趋势，核苷酸及其衍生物、胆碱、色氨酸等呈上升趋势，氨基酸及其衍生物和有机酸及其衍生物因功能不同在不同组中意义不同，总体上添加草药制剂呈上升趋势。

对血清差异代谢物进行 KEGG 数据库比对和富集分析，T1 vs Con 差异代谢物主要富集在嘌呤代谢、氨酰 - tRNA 生物合成等通路；T2 vs Con 主要富集在苯丙氨酸代谢、核苷酸代谢等通路；T2 vs T1 主要富集在嘌呤代谢、核苷酸代谢等通路。

对瘤胃内容物差异代谢物与瘤胃属水平前 10 种微生物进行 Pearson 相关性分析，发现 NK4A214_group 与大多数瘤胃代谢物呈正相关；uncultured_rumen_bacterium 与瘤胃代谢物组胺和 L - 精氨酸显著负相关，Prevotella 和 Ruminococcus 与这两种代谢物显著正相关；Lachnospiraceae_NK3A20_group 与鹅去氧胆酸显著负相关；Succiniclasticum 与肉碱 C2:0 显著负相关。对血清差异代谢物与瘤胃内容物属水平前 10 种微生物进行相关性分析，结果显示 uncultured_rumen_bacterium 与血清代谢物睾酮和鸟嘌呤显著负相关，Prevotella 和 Ruminococcus 与这两种代谢物显著正相关；Christensenellaceae_R_7_group 与胆酸和脱氧胆酸显著负相关；Lachnospiraceae_NK3A20_group 与 D - 果糖和肌醇显著负相关，与腺嘌呤正相关；Succiniclasticum 与尿素和肉碱 C2:0 显著负相关。

讨论

添加草药制剂后，湖羊平均日增重和平均日采食量显著高于 Con 组，饲料转化率显著降低。对湖羊瘤胃微生物种群进行 16S rRNA 测序，Alpha 多样性分析表明草药制剂显著降低了瘤胃微生物多样性，PCoA 分析进一步显示实验组间存在显著差异。Firmicutes 和 Bacteroidota 是瘤胃微生物的主要门，Firmicutes 促进纤维分解，Bacteroidetes 消化复杂碳水化合物。添加草药制剂后，T1 和 T2 组 Firmicutes 相对丰度升高，有利于其在瘤胃中的生存和定植。Prevotella 是瘤胃中的优势属，参与蛋白质、肽、淀粉和纤维的降解，添加草药制剂后其在瘤胃中的相对丰度增加，0.5% 草药制剂添加组中 Prevotella 相对丰度最高。Rikenellaceae_RC9_gut_group 可能参与碳水化合物和蛋白质发酵、促进脂质代谢，添加草药制剂后其相对丰度降低，这些都体现了营养成分变化对瘤胃微生物群落的影响。

利用 PICRUSt 软件预测微生物基因功能，发现三组微生物功能存在显著差异。T1 组中其他氨基酸代谢、聚糖生物<