黄热病中和抗体检测新方法：Vero 细胞微中和试验的开发与验证

《Microbiology Spectrum 3.7》：The development and validation of a microneutralization assay for the detection and quantification of anti-yellow fever virus antibodies in human serum

本文介绍一种基于 Vero 细胞的黄热病（YF）微中和（MN）试验，可检测和量化 YF 病毒中和抗体。

　　### 黄热病的威胁与现状
黄热病（Yellow Fever，YF）病毒是一种由蚊子传播的病毒，主要通过感染的伊蚊和趋血蚊叮咬人类。它属于正黄病毒属，是单链、正链核糖核酸病毒。黄热病在非洲、中美洲和南美洲的热带和亚热带地区流行，存在丛林、草原和城市三种独特的传播周期。多数黄热病感染无症状，但也可能引发轻度发热疾病，严重时会发展为出血热甚至导致死亡。2018 年，全球有大量严重感染病例和死亡病例，其中约 90% 的负担在非洲。目前，尚无特效药物治疗黄热病，疾病管理主要是支持性治疗。自 20 世纪 30 年代以来，基于 YF 17D 亚株的减毒活疫苗在疾病控制中发挥了关键作用，但传统疫苗生产过程缓慢、劳动密集，且受无病原体鸡胚供应限制，导致全球疫苗供应不足。相比之下，细胞培养生产平台具有快速、可持续、灵活等优势，赛诺菲（Sanofi）开发的基于 Vero 细胞的 YF-17D 疫苗已进入全球 III 期临床开发阶段。

黄热病检测方法的挑战

黄热病病毒感染的血清学诊断包括检测抗 YF 病毒特异性免疫球蛋白 M（IgM）抗体，或在近期未接种疫苗的情况下，检测急性期和恢复期样本中抗 YF 病毒 IgG 抗体滴度是否有四倍或更大的升高。参考实验室常用的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体试验、补体结合试验、log₁₀中和指数和空斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test，PRNT）等。此外，YF 病毒还可通过培养、免疫组化或逆转录聚合酶链反应等方法检测。然而，由于与其他正黄病毒（如登革热病毒和寨卡病毒）存在交叉反应，黄热病感染的血清学诊断较为复杂。PRNT 虽特异性较高，但需要专业人员操作，不适合高通量检测。因此，开发可靠的高通量检测方法对于黄热病的诊断监测以及候选疫苗的评估和许可至关重要。

YF 微中和试验的开发与验证

为了满足对黄热病病毒中和抗体检测的需求，研究人员开发了一种基于 Vero 细胞的 YF 微中和（Microneutralization，MN）试验，并进行了验证。该试验通过免疫染色读取结果，用于检测和量化人类血清中的 YF 病毒中和抗体。

1. 内部质量控制（IQC）的鉴定：研究人员对候选 IQC 样本进行了检测，确定了其有效滴度范围。结果显示，每个候选 IQC 样本超过 90% 的结果都在有效滴度范围内，符合验收标准。对阳性 IQC1 和 IQC2 候选样本进行 Shapiro-Wilk 检验，p 值大于 0.05，表明结果呈正态分布。
2. 人血清样本的短期稳定性：研究评估了人血清样本中 YF 病毒中和抗体在经历五次冻融循环或在 2°C 至 8°C 储存 14 天的短期稳定性。结果表明，在这些条件下，抗 YF 病毒中和抗体是稳定的，结果在两倍检测变异性范围内。
3. YF MN 试验与 YF PRNT 的血清学状态一致性评估：研究人员使用 YF MN 试验、YF PRNT₅₀（病毒空斑减少 50%）和 YF PRNT₈₀（病毒空斑减少 80%）对 236 份血清样本进行检测，比较它们之间的血清学状态一致性。对于有 YF 疫苗接种史的参与者，YF MN 试验与 YF PRNT₅₀的血清学状态一致性为 100%，与 YF PRNT₈₀的一致性为 96.5%；对于无 YF 疫苗接种史的参与者，YF MN 试验与 PRNT₅₀的一致性为 34.0%，与 YF PRNT₈₀的一致性为 100%。
4. 交叉反应性：为了评估 YF MN 试验与含抗登革热病毒（Dengue Virus，DENV）抗体的人血清样本的交叉反应性，研究人员对 38 份来自自然感染 DENV 个体的样本进行检测。结果发现，13%（5/38）的抗 DENV 阳性样本在 YF MN 试验中呈低阳性，观察到的 MN 滴度在 LLOQ（10，1/dil）的两倍范围内（11 - 17）。不过，这种低水平的交叉反应对专注于 YF 的流行病学或临床研究结果影响较小。
5. YF MN 试验的验证
   • 精密度：YF MN 试验的批内精密度（重复性）为 36%，批间精密度为 54%，均符合几何变异系数（% GCV）≤60% 的验收标准。
   • 定量限：该试验的定量上限（Upper Limit of Quantitation，ULOQ）为 10240，在定量下限（Lower Limit of Quantitation，LLOQ）为 10（1/dil）时，重复性 % GCV 为 38%，批间精密度 % GCV 为 41%，也符合验收标准。
   • 稀释准确性：YF MN 试验在检测 YF 病毒中和抗体时具有合适的稀释准确性，88%（21/24）的样本观察值与预期值的 log₂滴度绝对差值≤1.00。
   • 线性：该试验线性良好，所有样本（6/6）的 log - 线性回归分析 R²>0.95，斜率在 0.67 - 1.50 范围内。
   • 特异性：在存在其他抗黄病毒抗体和不同血清基质的情况下，YF MN 试验均表现出合适的特异性。所有加标样本（包括加标抗 DENV、抗日本脑炎病毒、抗寨卡病毒抗体样本以及加标溶血、脂血、黄疸血清基质样本）观察值与预期值的 log₂滴度绝对差值均 < 1.00。
   
   

讨论

本研究成功验证了一种新的基于细胞的 YF MN 试验，该试验适用于检测和量化人类样本中的 YF 病毒中和抗体，在批内精密度、批间精密度、稀释准确性、线性和特异性等方面均符合要求，是一种可靠的检测方法。在试验开发和验证过程中，研究人员建立了有效的 IQC 滴度范围，确认了血清样本中抗体的短期稳定性，并发现该试验与抗 DENV 抗体的交叉反应性较低。虽然 PRNT 在区分正黄病毒感染方面特异性较高，但正黄病毒之间的交叉反应仍是一个问题。YF MN 试验结合了较高的特异性和可接受的敏感性，对于有 YF 疫苗接种史的样本，与 YF PRNT₅₀的血清学状态一致性良好，对于未接种 YF 疫苗的样本，与更严格的 YF PRNT₈₀的一致性也很高。此外，研究还表明，多次冻融循环和在 4°C 储存对 YF 中和抗体的稳定性影响有限。值得注意的是，该 YF MN 试验已得到生物制品评估和研究中心（Center for Biologics Evaluation and Research，CBER）的认可，适用于疫苗临床试验中 YF 中和抗体滴度的检测。因此，这种经过验证的基于细胞的 YF MN 试验为黄热病的研究和疫苗开发提供了有力的工具。

材料和方法

1. 血清样本：IQC 人血清样本来自三名健康成年供体，其中 IQC1 和 IQC2 供体接种过 YF - VAX? 疫苗，IQC3 供体未接种过 YF 疫苗。用于比较 YF MN 试验和 YF PRNT 血清学状态一致性的血清样本来自健康供体（包括赛诺菲员工和先前 II 期临床研究参与者）。评估交叉反应性的抗 DENV 抗体阳性人血清样本来自自然感染 DENV 的供体，评估特异性的样本包括抗 DENV、抗 JEV、抗 ZIKV 抗体阳性人血清样本以及 Ig 耗尽的人血清样本。所有样本的获取均符合相关法规和赛诺菲的政策程序。
2. YF 病毒：YF 病毒（YF - 17D 株）工作批次在无血清 Vero 细胞中生产，并储存为一次性使用的等分试样。
3. YF PRNT 试验程序：将热灭活的血清样本进行系列两倍稀释，与恒定剂量的 YF 病毒孵育。Vero 细胞接种到 24 孔板中，血清样本以 1:5 初始稀释，与病毒混合后最终血清起始稀释度为 1:10。孵育后，将血清 - 病毒混合物接种到 Vero 细胞单层上，培养五天后用结晶紫溶液染色，通过计数空斑计算 YF PRNT₅₀或 YF PRNT₈₀中和抗体滴度。
4. YF MN 试验程序：热灭活的血清样本与靶向 100 个 50% 组织培养感染剂量（TCID₅₀）的 YF 病毒进行系列两倍稀释孵育。Vero 细胞接种到 96 孔微孔板中，血清样本以 1:5 初始稀释，最终血清起始稀释度为 1:10。孵育后，将血清 - 病毒混合物接种到 Vero 细胞单层上，培养两天后，通过与抗黄病毒包膜蛋白小鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶 IgG 结合物和显色底物反应，检测细胞中 YF 抗原的产生，使用酶标仪测量吸光度（OD，450nm）。
5. YF 病毒中和抗体滴度的计算：50% 中和滴度（MN₅₀）定义为相对于挑战病毒对照（无血清），病毒感染性降低 50% 时的测试血清稀释度的倒数。通过计算 50% 中和点，利用低于和高于该点的 OD 值对应的稀释度来插值计算每个样本的 YF 病毒中和抗体滴度。
6. IQC 的鉴定：对候选 IQC 样本进行检测，产生至少 30 个滴度。对于 YF 病毒中和抗体阳性的 IQC 样本，≥90% 的结果需在基于检测变异性（±2 倍几何平均滴度，GMT）的可接受滴度范围内；对于阴性 IQC 样本，目标滴度需 < 10，且≥90% 的结果低于检测的 LLOQ（<10）。使用 Shapiro - Wilks 检验和正态分位数 - 分位数图检查正态分布。
7. YF 病毒中和抗体的短期稳定性：制备包括 IQC 样本在内的测试血清样本等分试样，在冻融（五个循环）和 2°C 至 8°C 储存 14 天等条件下进行评估，将处理后的样本结果与未处理样本结果进行比较。
8. 交叉反应性评估：使用 YF MN 试验和先前验证的 DENV PRNT 对 38 份来自自然感染 DENV 个体的样本进行检测，评估 YF MN 试验对 DENV 抗体的交叉反应性。
9. YF MN 试验验证：评估 YF MN 试验的多个参数，包括批内精密度（重复性）、批间精密度、稀释准确性、线性、特异性、ULOQ 和 LLOQ。通过混合模型计算方差分量评估精密度，ULOQ 通过血清起始稀释度 1:20 检测确定，LLOQ 通过血清起始稀释度 1:5 检测确定。通过不同稀释度的血清样本检测稀释准确性和线性，通过加标和基质效应评估检测特异性。