《Microbiology Spectrum 3.7》：Integrated and high-throughput method to collect, store, recover, and manage microbial isolates in mini-arrays
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本研究提出了一种创新的微生物阵列培养技术，通过在微孔板中使用50%甘油（glycerol）在-20°C下实现微生物的高效收集、存储与管理，极大地简化了微生物样本的处理流程，并为大规模流行病学研究提供了有力支持。
引言
微生物的多样性在微生物学研究中具有重要意义，即使是单一微生物物种也展现出丰富的表型和基因型多样性。例如，大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）各自拥有超过100种荚膜类型，且其泛基因组（pangenome）包含超过1000个代表性菌株。这种多样性使得收集和管理大量微生物样本成为微生物学研究的基础，无论是在病原体毒力研究还是工业食品开发等领域。然而，传统的微生物收集和管理方法存在诸多挑战，如使用冻存管（cryovial）保存单个菌株，不仅操作繁琐，还容易导致样本混淆和标签错误。此外，随着疫苗研究的发展，对微生物样本的长期监测和管理需求日益增加，例如在使用肺炎疫苗时，需要对患者样本进行长期流行病学监测，以观察血清型变化。因此，开发一种高效、可靠的微生物收集和存储方法迫在眉睫。
材料与方法
培养基和溶液
研究中使用了多种商业培养基，包括Todd Hewitt（TH）肉汤、Luria-Bertani（LB）肉汤和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），并根据需要添加酵母提取物等成分。此外，还制备了酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基。所有培养基在使用前均经过滤灭菌，并在室温下保存。为了制备不同浓度的甘油溶液，先制备了80%的甘油溶液，然后通过稀释得到50%和30%的甘油溶液，其中50%的甘油溶液保存在4°C下。
微生物菌株
研究中使用了多种微生物菌株，包括肺炎链球菌的不同血清型菌株、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株、大肠杆菌（Escherichia coli）菌株、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株、痢疾杆菌（Shigella dysenteriae）菌株等。这些菌株分别来自不同的实验室或商业菌种保藏中心。
盐冰托盘
为了在采样过程中保持微孔板的低温环境，研究者设计了一个盐冰托盘。将一个小塑料平台放置在一个塑料容器底部，平台用于支撑微孔板。容器中加入氯化钠和冰块，然后将整个容器放置在一个装满冰块的冰桶中。这种设计能够在短时间内保持微孔板的温度在-15°C至-20°C之间，为甘油采样提供了理想的温度条件。
微生物阵列的制备
微生物阵列的制备过程如下：首先在含有500 μL培养基的微管中接种微生物，然后在CO?培养箱中培养至所需时间。培养完成后，向每个微管中加入30%的甘油，混合均匀后，将200 μL含有15%甘油的微生物悬浮液加入到96孔微孔板的每个孔中。对于384孔微孔板，则加入80 μL的微生物悬浮液。微孔板使用条形码进行标记，并用PCR封板膜密封后长期保存于-80°C冰箱中。
从保存的微生物阵列中恢复微生物
从-80°C冰箱中取出微孔板后，将其放置在-20°C冰箱中约1-1.5小时，然后转移到盐冰托盘上。在无菌条件下，向每个孔中加入25 μL 4°C的50%甘油，覆盖微孔板后静置5分钟。之后，从每个孔中取出约25 μL的液体，与500 μL的THY培养基混合，进行后续的微生物计数。采样完成后，微孔板重新密封并放回-80°C冰箱中保存。
多重免疫分析法检测肺炎链球菌血清型
研究中还开发了一种多重免疫分析法，用于检测从微生物阵列中恢复的肺炎链球菌菌株的血清型。该方法基于26种肺炎链球菌疫苗相关血清型的多重抑制型检测原理，通过将样本中的荚膜与26种不同血清型的单克隆抗体反应，利用流式细胞仪检测抗体与微球的结合量，从而实现对血清型的鉴定。
结果
微孔板中的原代培养物可以反复采样
研究假设在-20°C下，含有15%甘油的原代培养物会保持冻结状态，而50%的甘油则会保持液态，从而实现对特定孔中微生物的采样而不影响其他孔。实验结果表明，无论是未稀释的还是经过10倍和100倍稀释的肺炎链球菌培养物，都能通过甘油采样法成功恢复大量细菌。首次采样从未稀释的血清型1培养物中恢复了约10? CFU的细菌，而从1:99稀释的培养物中恢复了约1.9×10? CFU的细菌。经过10次反复采样后，采样效率并未降低，且微孔板中的原代培养物体积几乎没有减少。这表明甘油采样法能够在不破坏原代培养物的情况下，多次、高效地恢复微生物样本。
多种微生物在96孔微孔板中长期保存后的采样
为了验证微生物在微孔板中长期保存后的恢复能力，研究者制备了一个包含多种微生物菌株的96孔微孔板，包括11种肺炎链球菌菌株、2种化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）菌株、2种无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）菌株、2种金黄色葡萄球菌菌株、2种大肠杆菌菌株、1种痢疾杆菌菌株和1种酵母菌菌株。经过6个月的保存后，所有细菌菌株均能恢复超过2.5×10? CFU的细菌，其中16种菌株恢复了超过2.5×10? CFU的细菌。尽管酵母菌的原始培养物细胞密度较低，但也能恢复375 CFU的酵母菌。这表明多种微生物能够在微孔板中长期保存，并通过甘油采样法成功恢复。
新采样方法可以可靠地采样96孔微孔板中的菌株
为了测试甘油采样法的可靠性，研究者对960个孔（即10个96孔微孔板）的肺炎链球菌菌株进行了采样。结果表明，除了一个孔在初次采样时恢复了1.7×10? CFU的细菌外，其余959个孔均恢复了超过2.5×10? CFU的细菌。再次采样后，该孔也恢复了超过2.5×10? CFU的细菌，这表明初次采样量低可能是由于移液误差，而非采样方法的问题。此外，研究者还对其他微生物菌株进行了采样实验，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌，结果表明甘油采样法对多种微生物均具有良好的采样效果。
甘油采样技术适用于384孔微孔板
384孔微孔板由于其更高的孔密度，能够更高效地利用存储空间。研究者进一步测试了甘油采样法在384孔微孔板中的应用。实验结果表明，使用20 μL的50%甘油进行采样，能够从384孔微孔板中成功恢复大量细菌，且恢复的细菌数量与96孔微孔板相当。这表明384孔微孔板也是甘油采样法的一个可行平台，能够进一步提高微生物样本的存储效率。
经过11年冷冻保存后仍可恢复肺炎链球菌
肺炎链球菌能够产生大量具有血清型特异性的多糖荚膜，因此其菌株可以作为糖阵列（glyco-array）用于研究。为了验证微生物阵列在长期保存后的恢复能力，研究者从11年前制
