基于靶向富集的NGS技术在胃活检样本中直接评估幽门螺杆菌耐药组和毒力组的新方法

《Microbiology Spectrum 3.7》：Resistome and virulome determination in Helicobacter pylori using next-generation sequencing with target-enrichment technology

本研究开发了一种基于靶向富集的新一代测序（NGS）方法，可直接从胃活检样本中评估幽门螺杆菌的耐药组和毒力组，为临床治疗提供重要参考。

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是一种感染全球至少50%人口的细菌，其在胃部的定植与多种胃部疾病密切相关，包括胃溃疡和胃癌。传统的幽门螺杆菌感染诊断方法包括细菌培养、PCR检测以及非侵入性的尿素呼气试验等。然而，由于幽门螺杆菌的培养较为困难，且传统方法难以全面评估其耐药性和毒力特征，因此开发一种更高效、准确的检测方法具有重要意义。 本研究介绍了一种基于靶向富集的新一代测序（NGS）方法，用于直接从胃活检样本中分析幽门螺杆菌的耐药组和毒力组。研究人员利用Agilent SureSelectXT靶向富集协议和定制的RNA探针库，对19个幽门螺杆菌阳性的胃活检样本进行了分析。该方法能够检测与大环内酯类（macrolide）耐药相关的23S rDNA序列突变，以及与左氧氟沙星（levofloxacin）耐药相关的gyrase A基因突变，其检测限约为1.8×10? CFU/mL。此外，该方法还能够正确识别幽门螺杆菌的cagA基因和vacA基因型，并与传统的Sanger测序结果一致。 研究背景部分指出，幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性、微需氧、螺旋形且具有鞭毛的细菌，其在胃部的定植与胃溃疡和胃癌的发生密切相关。该细菌的毒力因子，如cagA基因编码的CagA蛋白和vacA基因编码的VacA毒素，与其致病性密切相关。cagA基因是致病性岛（cagPAI）的一部分，编码约30种组成IV型分泌系统的蛋白，CagA蛋白是一种癌蛋白，能够驱动炎症反应和细胞增殖，抑制细胞极性和凋亡。vacA基因在所有幽门螺杆菌菌株中都存在，但由于其N端信号序列（s1或s2）、中间区域（m1或m2）和中间区域（i1或i2）的遗传多态性，并非所有菌株都表达该基因。s1/m1多态性与胃溃疡和胃癌的高风险相关。 在材料与方法部分，研究人员详细描述了样本的收集和处理过程。19个胃活检样本均来自法国患者，平均年龄49.5岁，男女比例约为0.46。样本经培养和实时PCR确认为幽门螺杆菌阳性。研究人员使用Agilent MagnisDx NGS文库制备系统进行文库制备，并在Illumina iSeq 100测序仪上进行测序。为了评估该方法的检测限，研究人员将幽门螺杆菌CCUG 17874菌株以不同浓度加入到一个幽门螺杆菌阴性的胃活检样本中，并进行了酶解处理和测序。 在结果部分，研究人员展示了该NGS方法的灵敏度和检测限。在细菌负荷较低（<1.8×10? UFC/mL）的样本中，归因于幽门螺杆菌的测序读段百分比<10%。随着细菌负荷的降低，人类读段的百分比增加。在混合耐药菌株的实验中，该方法能够在1:10的耐药菌株比例下检测到突变等位基因，但在1:100的比例下则无法检测到。在临床样本的耐药标志物检测中，19个样本均通过实时PCR检测到幽门螺杆菌，且与通过靶向富集检测到的23S rDNA突变结果高度一致。研究人员还对cagA阳性的菌株进行了全基因组测序，以确定CagA蛋白的EPIYA磷酸化基序。 在讨论部分，研究人员指出，该NGS方法能够可靠地检测幽门螺杆菌的耐药组和毒力组，且检测限能够覆盖约68%的PCR阳性但培养阴性的活检样本。该方法在检测耐药突变方面具有较高的灵敏度，尤其是在检测混合耐药菌株时具有优势。此外，该方法还能够准确地进行MLST分型，为临床治疗提供了重要的参考信息。研究人员还提出了对该方法的进一步改进方向，包括提高cagA基因磷酸化基序检测的灵敏度和增加针对htrA基因的探针设计。 综上所述，本研究开发的基于靶向富集的NGS方法为幽门螺杆菌感染的诊断和治疗提供了新的思路和工具。该方法能够直接从胃活检样本中快速、准确地评估幽门螺杆菌的耐药组和毒力组，为临床医生制定个性化的治疗方案提供了重要依据。