SMU.1147：变形链球菌致病与生存的关键调控基因

本文揭示变形链球菌中 SMU.1147 基因在代谢调节、应激反应和细胞活力中的关键作用。

　　### 引言
龋齿的发展机制一直是科研人员关注的重点。口腔硬组织上的生物膜经历酸化和碱化循环，当脱矿作用超过再矿化时，龋齿便会发生。变形链球菌（Streptococcus mutans）作为主要的致龋病原体，在这一过程中扮演着关键角色。它能有效竞争碳源和能源，并迅速适应营养源的变化。

群体感应（quorum sensing）在细菌生物膜形成中至关重要，通过感知分泌的小分子进行细胞间通讯。对于变形链球菌而言，基于肽的群体感应尤为重要。其中，由comC编码的感受态刺激肽（competence-stimulating peptide，CSP）和 ComRS 信号通路中的相关肽，对调节基因表达和毒力起着核心作用。

变形链球菌的独特核心基因组（unique core genome，UCG）中的基因影响着其生长、应激耐受性、生物膜形成和感受态等多个方面。SMU.1147c 基因编码一个 61 个氨基酸的肽（ScnC），存在于所有已检测的变形链球菌菌株中，且似乎是该细菌特有的。它与双组分信号转导系统（two-component signal transduction system，TCS）中的scnK和scnR在操纵子结构中转录。此前研究表明，SMU.1147 影响毒力相关表型，但其作用机制尚不完全清楚。本研究旨在阐明 SMU.1147 调节细菌行为的机制，为控制变形链球菌的致龋潜力提供策略。

结果

1. SMU.1147 对变形链球菌基因表达的贡献：通过 RNA 测序（RNA-seq）分析 SMU.1147 突变株和野生型（WT）变形链球菌菌株的基因表达谱，发现两者存在显著差异。有 79 个基因上调，270 个基因下调。基因本体和通路分析显示，差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）富集在细胞相互作用、防御机制和转运相关通路，尤其是应激反应和代谢适应相关基因变化显著。例如，编码 ABC 转运蛋白的lctFEG基因上调，而与氧化应激抵抗相关的spxA2基因下调。此外，参与热休克反应和低 pH 适应的dnaK操纵子上调。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析表明，TCS 和群体感应通路相关基因也发生改变，同时丙酮酸代谢相关基因上调，这表明 SMU.1147 调节着与应激耐受、致病性和代谢过程相关的关键基因。
2. SMU.1147 突变对细胞代谢和细胞过程相关基因的影响：SMU.1147 突变导致ciaXHR、htrA、comX和comR等基因表达下调，而scnK和scnR表达不变，说明 SMU.1147 选择性调节下游基因。同时，酶 I（EI，由ptsI编码）以及参与麦芽糖和海藻糖代谢的基因上调，PTS 实验也证实突变株对麦芽糖、海藻糖和蔗糖的摄取增加，但生长速率和 ATP 产量无显著差异，这表明突变株在将摄取的糖转化为能量方面存在问题。
3. SMU.1147 突变对有机酸产生的影响：尽管突变株中糖代谢基因上调，但与野生型菌株相比，其产生的有机酸更少。在以葡萄糖、麦芽糖或海藻糖为碳源时，野生型菌株的 pH 下降更快、更明显，而在蔗糖培养基中，两者 pH 差异不显著。这表明 SMU.1147 缺失导致突变株代谢转变，碳流向有机酸产生的过程减少，可能是由于糖酵解或发酵途径的中断。
4. 对细胞生长和存活的影响：在脑心浸液（brain heart infusion，BHI）培养基中，野生型和突变株的生长速率无显著差异，但突变株的菌落形成单位（colony-forming units，CFU）在 8 小时和 24 小时明显减少，互补菌株的 CFU 恢复到野生型水平，证实了该缺陷与 SMU.1147 缺失相关。LIVE/DEAD 染色结果显示，突变株在 16 小时时细胞死亡增加。此外，在化学限定培养基（FMC）中，突变株生长速率改变，这表明 SMU.1147 缺失对生长的影响高度依赖于代谢环境，其对变形链球菌在不同环境下的代谢灵活性和生存至关重要。

讨论

口腔环境不断变化，变形链球菌需要快速适应才能生存。SMU.1147 作为变形链球菌的独特核心基因，在调节生物膜形成、应激反应和遗传感受态方面发挥着重要作用。

转录组分析表明，SMU.1147 缺失导致参与糖代谢和应激管理的基因上调，如lctFEG ABC 转运蛋白簇，这可能是突变株应对外部威胁的一种补偿机制。同时，PTS 转运体和丙酮酸代谢相关基因的上调，显示突变株试图增强糖摄取和应对能量及应激问题，但 ATP 产量未增加，有机酸产生效率降低，说明其能量代谢协调受到破坏，可能导致代谢优先转向应激管理，但补偿机制并不完全有效。

在应激反应方面，SMU.1147 缺失使spxA2等应激相关基因表达下调，影响氧化应激耐受性和蛋白质质量控制。此外，参与蛋白质降解的clpP和clpX基因下调，进一步表明突变株在应激条件下管理蛋白质质量的能力受损，影响细菌适应性。同时，Spx 蛋白表达减少可能限制生物膜形成，影响细菌在波动环境中的生存。

SMU.1147 还影响遗传感受态机制。htrA和ciaRH等基因表达降低，虽理论上应减轻对感受态的负调控，但突变株并未出现预期的感受态增加，这可能是由于应激反应受损限制了细胞利用这种负调控的缓解。此外，SMU.1147 参与 ScnRK TCS，提供了一种独立于传统 CSP 和 XIP 途径的新型调节机制，使变形链球菌能更好地适应环境。

综上所述，SMU.1147 是变形链球菌代谢和应激反应途径的关键调节因子，影响其适应环境波动和维持致病潜力的能力。这些发现为进一步研究 SMU.1147 与其他调节系统的相互作用机制，以及控制变形链球菌在口腔中的致病性提供了新的方向。

材料和方法

1. 菌株、培养条件和生长测量：使用野生型变形链球菌 UA159、SMU.1147 缺失突变株和互补菌株，大肠杆菌 DH10B 作为穿梭载体的宿主。变形链球菌在 BHI 培养基中，37°C、5% CO₂条件下培养；大肠杆菌在 LB 培养基中，37°C 有氧条件下培养，根据需要添加抗生素。在生长实验中，将菌株在 BHI 培养基中预培养后，稀释至新鲜培养基中，在特定条件下用酶标仪监测生长，或在添加不同碳水化合物的培养基中培养并创造限氧条件观察生长情况。
2. RNA 分离、转录组分析和 qRT-PCR：将细胞培养至对数后期，离心收集细胞，用细菌 RNA 保护试剂处理后，经一系列操作分离总 RNA 并测定浓度。RNA-seq 分析由专业服务提供商进行，基于参考基因组分析差异表达基因，进行功能注释和通路分析。同时，以 1 μg RNA 为模板合成 cDNA，用特定引物和试剂进行实时荧光定量 PCR（qRT-PCR），以 16S rRNA 基因为内参，采用 2^?ΔΔCt法进行相对定量分析。
3. 磷酸烯醇式丙酮酸依赖的 PTS 测定：采用 PTS 测定法检测磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）依赖的转运活性。将细胞培养至对数前期，接种到含不同碳水化合物的培养基中，收获细胞并洗涤、透化，加入反应混合物，通过测量 NADH 氧化速率来测定 PTS 活性，并根据蛋白质浓度进行归一化处理。
4. pH 下降测定：通过 pH 下降测定评估酸终产物的产生。将细胞培养、稀释、收获后，洗涤并调整 pH，加入碳水化合物源，用 pH 计监测 30 分钟内的 pH 变化。
5. 细胞活力测定：将细胞培养、稀释至对数前期，在不同时间点进行系列稀释并涂布平板，计算活细胞数量。同时，用 LIVE/DEAD BacLight 细菌活力试剂盒染色，在显微镜下观察细胞活力。
6. 转化测量：按照先前描述的方法测量转化效率。将过夜培养物稀释，添加马血清和合成 CSPs 孵育，再加入含抗性基因的质粒，厌氧培养后，通过在抗性平板上计数菌落来测定转化效率，并在非选择性平板上计数调整细胞数量。
7. 统计分析：所有实验独立重复至少三次，采用单因素方差分析和 Student's t 检验，以 P < 0.05 为具有统计学意义。