《Microbiology Spectrum 3.7》：Marek’s disease virus protein kinase US3 inhibits DNA-sensing antiviral innate immunity via abrogating activation of NF-κB
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本文揭示马立克氏病病毒（MDV）的蛋白激酶 US3 抑制宿主抗病毒免疫的新机制，为防控 MDV 感染提供新思路。
一、引言
马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）作为一种禽类 α 疱疹病毒，是引发马立克氏病（Marek’s disease，MD）的病原体。MD 是一种会导致鸡免疫抑制和淋巴细胞增殖的疾病，可快速诱发淋巴瘤以及多种非肿瘤综合征 。MDV 所属的 α 疱疹病毒亚科，还包含伪狂犬病病毒、牛疱疹病毒 1 型等动物疱疹病毒，以及单纯疱疹病毒 1 型和 2 型（HSV-1 和 HSV-2）、水痘 - 带状疱疹病毒等人类疱疹病毒。尽管有疫苗可用，但 MDV 感染仍在家禽群体中传播。易感鸡通过呼吸道吸入感染鸡脱落的传染性皮屑而被感染。MDV 感染后，会先在巨噬细胞和 B 细胞中进行早期溶细胞复制，随后潜伏感染 T 淋巴细胞，使 T 淋巴细胞发生转化，最终在内脏器官中形成致命的淋巴瘤 。然而，MDV 感染对机体固有免疫和适应性免疫应答的影响机制，仍有待深入探究。
固有免疫是宿主抵御感染的首道防线，通过诱导 I 型干扰素（type I interferon，IFN-I）和一系列抗病毒效应分子发挥作用。病毒核酸是重要的病原体相关分子模式，可被宿主模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别，进而激活 IFN-I 通路。该通路最终诱导多个干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）表达，启动固有抗病毒应答。近年来，研究发现多种胞质 DNA 传感器能够识别微生物病原体 DNA。其中，环鸟苷单磷酸 - 腺苷单磷酸合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）是在不同细胞类型中识别多种 DNA 配体的主要胞质 DNA 传感器。当 cGAS 感知到病毒 DNA 时，会催化第二信使环鸟苷单磷酸 - 腺苷单磷酸（cyclic GMP-AMP，cGAMP）的合成。cGAMP 与干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）相互作用并激活它。激活的 STING 会招募 TANK 结合激酶 1（TANK-binding kinase 1，TBK1），使转录因子干扰素调节因子 3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和核因子 κB（nuclear factor κB，NF-κB）磷酸化。随后，IRF3 和 NF-κB 转移到细胞核内，诱导 IFN-I 和多种炎性细胞因子的产生。
尽管在病毒感染期间，胞质 DNA 传感通路会被激活，但疱疹病毒已进化出多种机制来逃避宿主的抗病毒固有免疫。例如，卡波西肉瘤相关疱疹病毒的 vIRF1 蛋白和人类巨细胞病毒的 UL82 蛋白，可通过阻止 STING 与 TBK1 结合或破坏其亚细胞转运来抑制 STING 激活。研究表明，HSV-1 能在多个层面逃避 DNA 传感通路，包括通过多种 DNA 传感器的识别以及 IRF3 或 NF-κB 轴的固有免疫信号传导 。逃避抗病毒固有免疫对于病毒在宿主细胞中的持续感染和复制至关重要。
鸟类是许多可感染人类病毒的重要宿主。鸡的 PRRs 与哺乳动物不同，鸡缺乏 TLR9 和 RIG-I。鸡、鸭和鹅的 cGAS 的 N 端较短，与人类 cGAS 的相似性分别仅为 22.4%、17.4% 和 7.7%。鸡缺乏 IRF3，但功能性 IRF7 的存在被认为可补偿 IRF3 的缺失。NF-κB 转录因子在鸡中表达，其功能可能与哺乳动物相似。与哺乳动物一样，cGAS-STING 轴在限制禽类 DNA 病毒感染中起着关键作用。然而，像 MDV、传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒等鸡 DNA 病毒，如何逃避 cGAS-STING 介导的抗病毒信号传导，目前仍不清楚。
MDV 编码一种在 α 疱疹病毒亚科中保守的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 US3。US3 的同源物包含一个激酶活性结构域，由 ATP 结合结构域和活性催化位点组成，这对其激酶活性至关重要。越来越多的证据表明，α 疱疹病毒的 US3 在病毒感染的多个过程中发挥重要作用，包括病毒粒子成熟、核出芽、抑制细胞凋亡、细胞间传播和细胞骨架重排 。HSV-1 的 US3 还参与病毒免疫逃逸，可抑制 IFN-I 产生并下调主要组织相容性复合体 I 类分子的表面表达 。虽然 US3 在其他 α 疱疹病毒中的功能已被广泛研究，但 MDV US3 在调节鸡固有免疫中的生物学功能及其底物尚未得到详细研究。
本研究旨在鉴定 MDV US3 在 DNA 传感通路中的细胞底物，并探究其在逃避宿主固有免疫中的作用。研究结果揭示了 MDV 逃避宿主抗病毒免疫的一种新机制，即 MDV US3 与 NF-κB 亚基 p65 和 p50 相互作用并使其过度磷酸化，从而抑制 NF-κB 的核转位和激活，最终导致 IFN-I 产生受阻。
二、结果
（一）MDV US3 抑制由 ISD、cGAS-STING 和 DNA 病毒诱导的 IFN-β 和 IL-6 产生
DF-1 细胞系是一种鸡成纤维细胞系，已知其对外源 DNA（如干扰素刺激 DNA，interferon-stimulatory DNA，ISD）和聚（dA?dT）有反应。为验证 MDV US3 在调节 IFN-β 产生中的作用，研究人员将外源性 DNA 传感刺激物 ISD 和 US3 表达质粒或空载体（empty vector，EV），与 IFN-β 启动子 - 荧光素酶报告质粒共转染到 DF-1 细胞中，然后使用双荧光素酶报告（dual-luciferase reporter，DLR）实验检测 IFN-β 启动子活性。结果显示，US3 的异位表达显著抑制了 ISD 触发的 IFN-β 启动子激活。通过实时定量 PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞中 IFN-β 的 mRNA 和蛋白水平发现，在 DNA 刺激下，转染 EV 的细胞中 IFN-β 的 mRNA 和蛋白水平显著增加，而在表达 US3 的 DF-1 细胞中，这种增加被减弱，这表明 US3 抑制了胞质 DNA 诱导的 IFN-β 产生。此外，在 DF-1 细胞中，US3 的异位表达还降低了 IL-6 的产生。
为确定 US3 是否能抑制 cGAS-STING 介导的 IFN-β 产生，研究人员将 US3 表达质粒与 cGAS、STING 表达质粒以及 IFN-β 启动子 - 报告质粒共转染到 DF-1 细胞中。结果显示，US3 的异位表达显著抑制了 cGAS-STING 介导的 IFN-β 启动子激活，并且在表达 US3 的 DF-1 细胞中，IFN-β 的转录和蛋白水平显著降低。研究还发现，US3 抑制了由 cGAMP（cGAS-STING 信号通路的第二信使）诱导的 IFN-β 启动子激活和 IFN-β 产生。这些结果表明，MDV US3 抑制了 cGAS-STING 介导的 DNA 传感通路。研究人员用火鸡疱疹病毒（herpesvirus of turkey，HVT）感染表达 US3 的 DF-1 细胞，发现与对照细胞相比，表达 US3 的细胞对该 DNA 病毒的 IFN-β 反应减弱，且感染的 HVT 在表达 US3 的细胞中复制滴度更高。这些结果进一步证实，cGAS-STING DNA 传感信号通路被 MDV US3 抑制。
（二）MDV US3 抑制 NF-κB 的激活
转录激活因子 NF-κB 对于诱导鸡细胞中的 IFN-I 和其他细胞因子至关重要。为阐明 MDV US3 抑制 IFN-β 的机制，研究人员使用先前描述的 DLR 实验分析了 US3 对 NF-κB 激活的影响。结果显示，US3 抑制了由 cGAS-STING 介导的 NF-κB 依赖性荧光素酶活性，这表明 US3 能够抑制 DNA 传感通路中 NF-κB 的激活。为进一步明确在 IFN-β 激活过程中 US3 靶向的通路成分，研究人员将 US3 表达质粒、NF-κB-Luc 报告质粒以及编码 NF-κB 信号通路成分（包括 IKKα、IKKβ、p65 和 p50）的表达质粒共转染到 DF-1 细胞中。结果发现，所有 NF-κB 衔接蛋白均能使 NF-κB-Luc 报告基因活性诱导增加约 10 - 40 倍，但 US3 抑制了由所有 NF-κB 信号通路成分介导的 NF-κB 激活。这些发现表明，US3 可能通过靶向所有 NF-κB 亚基来抑制 DNA 传感通路。
（三）MDV US3 的激酶活性对抑制 DNA 传感信号至关重要
为确定 US3 的激酶活性是否是抑制 DNA 传感信号所必需的，研究人员构建了一个激酶失活的 US3 突变体 US3K220A。将表达质粒共转染到 DF-1 细胞中，检测其抑制 cGAS-STING 介导的 IFN-β 和 NF-κB 报告基因活性的能力。结果显示，野生型 US3 的异位表达抑制了 cGAS-STING 介导的 IFN-β 和 NF-κB 报告基因的激活，而 US3K220A 突变体的异位表达未能抑制 IFN-β 和 NF-κB 启动子的激活。此外，US3K220A 突变体对 p65 和 p50 诱导的 NF-κB-Luc 活性没有显著影响。这些结果表明，US3 的激酶活性对于抑制 DNA 传感信号至关重要。
（四）MDV US3 与 p65 和 p50 相互作用
为阐明 US3 抑制 DNA 传感通路的分子机制，研究人员探究了 US3 与信号通路成分之间相互作用的可能性。将 US3-Flag 和 p65-HA 或 p50-HA 转染到 HEK293T 细胞中，并用抗 HA 和抗 Flag 抗体进行免疫共沉淀实验。结果发现，p65 和 p50 能免疫沉淀 US3，反之，US3 也能免疫沉淀 p65 和 p50。研究人员还发现，内源性的 p65 和 p50 也能被 US3 免疫沉淀。研究人员检测了 US3 与 IKKα 和 IKKβ 的相互作用，发现 US3 与它们没有相互作用。
p65 和 p50 都含有一个 Rel 同源结构域（Rel homology domain，RHD），该结构域对蛋白质二聚化、DNA 结合、与 IκB 的相互作用以及核转位至关重要。实验表明，p65RHD 和 p50RHD 都能被 US3 有效免疫沉淀。这些结果表明，US3 与 p65 和 p50 的 RHD 结构域相互作用，使上述转录激活因子磷酸化并阻断它们的核转位，从而导致 DNA 传感信号的抑制。
（五）MDV US3 使 p65 和 p50 磷酸化并减少其核转位
研究人员探究 p65 和 p50 是否是 MDV US3 蛋白激酶的底物。将 p65 或 p50 表达质粒单独或与编码 US3 或 US3K220A 的质粒共转染到 DF-1 细胞中进行验证。结果显示，在表达 US3 的情况下，p65 出现了迁移较慢的条带，而在表达 US3K220A 时则没有，且这种迁移较慢的 p65 条带可被 Lambda PP 处理消除。同样，US3 的表达也诱导了 p50 出现迁移较慢的条带，在 US3K220A 表达时该条带显著减少，经 Lambda PP 处理后消失。这些结果表明，p65 和 p50 被 US3 磷酸化，且 US3 的激酶活性不可或缺。
p65 和 p50 的核转位对于 NF-κB 相关基因的转录至关重要。为确定 US3 是否阻止这些 NF-κB 亚基的转运，研究人员将编码 US3 或 US3K220A 的质粒转染到 DF-1 细胞中，监测 ISD 刺激下内源性 p65 和 p50 的核转运情况。结果显示，ISD 刺激导致细胞核中 p65 和 p50 的水平增加，而异位表达 US3 减少了 ISD 诱导的 p65 和 p50 的核转运，且 US3 激酶失活突变消除了 US3 对 p65 和 p50 核转位的抑制作用。为在 MDV 感染的背景下研究 US3 的上述功能，研究人员将 US3 缺陷型 MDV 接种到鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts，CEFs）中。与感染野生型 MDV 的细胞相比，感染 MDV-dUS3 的细胞在细胞核中检测到更高水平的 p65 和 p50。这些结果表明，MDV US3 诱导 p65 和 p50 的磷酸化并减少它们的核转位。
（六）US3 有助于 MDV 逃避固有免疫应答
研究人员检测了感染野生型或 US3 缺陷型 MDV 的细胞中 IFN-β 和 IFN 刺激基因的表达。结果显示，在 CEFs 中，MDV-dUS3 诱导的 IFN-β 以及 IFN 刺激基因 ZAP 和 IFN 诱导跨膜蛋白 3（IFN-inducible transmembrane protein 3，IFITM3）的 mRNA 水平显著高于野生型 MDV 诱导的水平。进一步研究发现，与野生型 MDV 相比，MDV-dUS3 在 CEFs 中的复制能力下降。研究人员将 p65 或 p50 特异性的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）转染到 CEFs 中，比较野生型 MDV 和 MDV-dUS3 在这些细胞中的复制情况。结果显示，与野生型 CEFs 相比，MDV-dUS3 在 p65 或 p50 敲低的细胞中产生的病毒量下降幅度较小。这些结果表明，US3 通过 NF-κB 依赖的途径促进 MDV 复制。
研究人员用野生型 MDV 或 US3 缺陷型 MDV 感染无特定病原体（specific-pathogen-free，SPF）鸡，检测 IFN-β、IFN 刺激基因以及 NF-κB 调节的细胞因子 IL-6 的表达。结果显示，与野生型 MDV 相比，US3 缺陷型 MDV 在感染鸡 14 天和 28 天后诱导的 IFN-β 水平显著更高，IL-6、ZAP 和 IFITM3 的表达水平也明显更高。通过 qPCR 分析感染鸡的病毒 DNA 载量发现，在感染早期（3 天），MDV-dUS3 的病毒复制水平与野生型 MDV 相似，但在感染 7 天后，MDV-dUS3 的病毒载量比野生型 MDV 降低了 100 - 1000 倍。这些结果表明，US3 对 MDV 早期溶细胞感染并非必需，但可能在 MDV 感染的后期阶段（包括潜伏期、再激活和转化）发挥作用。总体而言，这些研究表明，US3 与 p65 和 p50 相互作用，在 MDV 感染期间抑制 IFN-β 的产生，从而逃避抗病毒固有免疫。
三、讨论
固有免疫应答在宿主抵御病毒感染中起着关键作用。在疱疹病毒感染过程中，病毒 DNA 释放到细胞质中，触发 cGAS-STING DNA 传感通路的激活，导致 IRF3 和 NF-κB 的激活，进而产生 IFN 和炎性趋化因子来抑制疱疹病毒的复制。然而，病毒已进化出多种免疫逃逸策略来抑制 IFN-I 的产生，促进病毒的感染和复制。对于 MDV 来说，这些策略尤为重要，因为其周期性的裂解复制和新感染在自然情况下会发生，并且是其在宿主中长期持续存在和致病所必需的。与哺乳动物病毒相比，鸡 DNA 病毒阻断 cGAS-STING 通路的策略尚不清楚。研究人员之前报道，MDV 的主要癌蛋白 Meq 通过与 STING 和 IRF7 相互作用抑制该通路，阻止 STING-TBK1 和 STING-IRF7 的结合，抑制 IRF7 的激活和 IFN-I 的产生。MDV 编码的 VP23 和 RLORF4 蛋白通过拮抗 IRF7 或 NF-κB 的激活来阻断 DNA 传感通路。在本研究中，研究人员通过对 MDV 开放阅读框的筛选，发现 MDV 蛋白激酶 US3 是 IFN-I 诱导的有效抑制剂。US3 通过与 NF-κB 亚基 p65 和 p50 相互作用，抑制这些转录因子的核转位，最终抑制 MDV 感染期间 IFN-I 的产生。
先前的报道表明，α 疱疹病毒编码的 US3 蛋白激酶是一种多功能蛋白，对病毒感染和复制至关重要。已鉴定出多种细胞和病毒蛋白是 HSV-1 US3 的底物，包括病毒蛋白 UL31、UL34、gB 和 dUTPase，以及细胞蛋白如 IRF3、p65、组蛋白去乙酰化酶 1（histone deacetylase 1，HDAC-1）、HDAC-2、β - 连环蛋白和 II 型驱动蛋白运动蛋白 KIF3A。MDV US3 于 1993 年首次被描述，已证实其与其他 α 疱疹病毒编码的 US3 同源物在调节病毒粒子形态发生、细胞凋亡和宿主细胞骨架结构方面具有相似功能。有研究报道，MDV US3 与病毒癌蛋白 Meq 和 pp38 相互作用并使其磷酸化。细胞蛋白 cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）、HDAC1 和 HDAC2 也是 MDV US3 的底物。MDV US3 还被发现以依赖其激酶活性的方式破坏早幼粒细胞白血病蛋白核体。之前的研究表明，MDV US3 通过靶向 IRF7 阻断 IFN-β 的产生来促进病毒复制。在本研究中，MDV US3 进一步被证明是鸡 DNA 传感通路<
