宫颈微生物群与试管婴儿胚胎植入失败的关联及预测模型构建

本文探究宫颈微生物群对体外受精 - 冻融胚胎移植（IVF-FET）结局的影响并构建预测模型。

　　

引言

不孕不育已成为全球性公共卫生问题，在中国，育龄夫妇不孕不育的发生率达 17.6%。体外受精 - 胚胎移植（IVF-ET）是治疗不孕不育的有效方法，但经过近半个世纪的发展，其累积妊娠率仍徘徊在 50% 左右，反复植入失败（RIF）和反复自然流产（RSA）是辅助生殖技术面临的重大挑战，约 10% 经历三次胚胎移植的女性会遭遇 RIF，每个移植周期中 12%-15% 的女性会发生流产。

人体存在大量微生物，约 9% 的微生物存在于女性生殖道，对女性生殖健康影响重大。健康的阴道微生物群通常以乳酸杆菌（Lactobacillus）为主，而乳酸杆菌占比小于 90% 的非乳酸杆菌主导的阴道微生物群，往往与较高的 Nugent 评分和细菌性阴道炎（BV）相关。在健康女性中，阴道微生物群里乳酸杆菌的比例通常大于 90%，且可分为四种类型（卷曲乳酸杆菌 Lactobacillus crispatus、詹氏乳酸杆菌 Lactobacillus jensenii、惰性乳酸杆菌 Lactobacillus iners 和加氏乳酸杆菌 Lactobacillus gasseri ）。其中，卷曲乳酸杆菌被认为与良好的健康结局相关，而惰性乳酸杆菌则与不良结局，如细菌性阴道炎、人乳头瘤病毒（HPV）感染、胚胎植入失败等疾病有关。上生殖道中的乳酸杆菌能促进健康的生殖道环境，相反，子宫微生物群失调则预示着一系列疾病，如慢性子宫内膜炎（CE）和反复自然流产（RSA） 。

宫颈 - 阴道上皮与乳酸杆菌形成的平衡共生屏障可抵御病原体入侵。一旦这种平衡被打破，就可能导致不良生殖结局，如性传播疾病、盆腔炎、不孕和流产等，还与 IVF-ET 后的妊娠建立有关。有研究表明，细菌性阴道炎导致的异常阴道微生物群与临床妊娠阴性相关，双歧杆菌（Bifidobacterium）、普雷沃菌（Prevotella）、惰性乳酸杆菌和链球菌（Streptococcus）等微生物会导致妊娠失败 。乳酸杆菌主导的微生物群（LDM，乳酸杆菌占比≥90% ）个体的临床妊娠率，显著高于非乳酸杆菌主导的微生物群（NLDM，乳酸杆菌占比 < 90% ）个体，而且乳酸杆菌还可能用于预测 IVF-ET 的良好结局。

然而，也有研究得出了不同结论。有学者发现，接受 IVF-ET 治疗的怀孕和未怀孕个体，其宫颈和子宫中乳酸杆菌的丰度没有明显差异；首次接受胚胎移植的患者和经历 RIF 的患者，子宫微生物群中乳酸杆菌的丰度也没有显著差异，且严格厌氧菌和加德纳菌（Gardnerella）的流行率差异，对妊娠率没有有害影响。因此，需要更严谨的研究，来确定女性生殖道微生物群是否影响 IVF-ET 的结局。本研究旨在探讨宫颈微生物群异常在胚胎植入失败中的作用，并基于宫颈微生物群特征开发胚胎植入失败的预测模型。

结果

1. 宫颈微生物群多样性和组成分析：研究共纳入 131 名患者，其中 47 例胚胎植入失败（非妊娠 NP 组），84 例临床妊娠（CP 组）。对宫颈微生物群进行分析，共鉴定出 4299 个操作分类单元（OTUs）。通过香农指数（P = 0.15）和辛普森指数（P = 0.17）计算微生物群的 α 多样性，NP 组和 CP 组之间没有显著差异。在门水平上进行主成分分析（PCA）和主坐标分析（PCoA），两组之间也无显著差异。在属和种水平上的 β 多样性分析，同样显示两组之间没有显著差异，两组样本重叠度高。

在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）是两组宫颈微生物群的优势菌，NP 组和 CP 组中厚壁菌门的平均相对丰度分别为 83.377% 和 84.020%，差异无统计学意义（P = 0.291）。在所有菌门中，只有梭杆菌门（Fusobacteriota）在 NP 组和 CP 组之间存在显著差异（0.204% vs. 0.024%，P = 0.008） 。

在属水平上，两组的组成相似，但嗜盐单胞菌（Halomonas）、克雷伯菌（Klebsiella）、阿托波菌（Atopobium）和小乳酸杆菌（Ligilactobacillus）在两组间存在明显差异。乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌在两组中的相对丰度均超过 1%，而普雷沃菌、嗜盐单胞菌和气球菌（Aerococcus）仅在 NP 组中的相对丰度高于 1% 。共有 21 个属在两组之间存在显著差异。在种水平上，无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、普氏粪杆菌（Prevotella copri）、史蒂文斯嗜盐单胞菌（Halomonas stevensii）等物种在两组间有明显差异。共有 44 个种在两组之间存在显著差异。

2. 随机森林分析：运用随机森林算法，确定影响胚胎植入的关键微生物生物标志物。该模型由 1000 棵决策树组成，通过平均减少准确率（MDA）评估特征重要性。结果显示，在属水平上，嗜盐单胞菌对模型的贡献最大，MDA 值最高，此外，普雷沃菌、无色杆菌（Achromobacter）、阿托波菌、韦荣球菌（Veillonella）等也对模型有贡献。在种水平上，史蒂文斯嗜盐单胞菌对模型的贡献最大，其次是普氏粪杆菌、未分类的无色杆菌等。
3. 胚胎植入失败预测模型的建立和验证：将随机森林分析中 MDA 评分排名前十的属，作为分类预测因子（阳性或阴性）纳入多变量二元逻辑回归模型，采用向后 LR 法进行逐步回归，并将乳酸杆菌的相对丰度纳入模型。最终的预测模型包含嗜盐单胞菌、阿托波菌和韦荣球菌的分类，以及乳酸杆菌的相对丰度。通过自抽样法进行内部验证，模型的平均受试者工作特征曲线（ROC）下面积（AUC）为 0.718（95% 置信区间：0.628 - 0.807，P < 0.001） 。

为评估模型的泛化能力，使用来自项目 PRJNA903403 的独立数据集进行外部验证，该数据集包含 120 名接受 IVF 治疗患者的宫颈微生物群 16S 全长测序数据。外部验证结果显示，模型的平均 ROC 曲线 AUC 为 0.654（95% 置信区间：0.553 - 0.755，P = 0.037） ，尽管外部数据的受试者特征与本研究存在差异，但模型在外部验证中仍表现出稳健的预测准确性。

讨论

本研究探讨了宫颈微生物群与胚胎植入结局的关系，并建立了基于宫颈微生物群的胚胎植入失败临床预测模型。研究发现，宫颈微生物群的组成与胚胎植入有关，虽然 NP 组和 CP 组的宫颈微生物群多样性没有显著差异，但特定细菌在两组间存在显著差异。通过随机森林算法确定了对区分 NP 和 CP 有显著贡献的属，预测模型经内部和外部验证，AUC 均大于 0.6，具有潜在的临床应用价值。

胚胎的成功植入和健康生长，依赖于优质的胚胎、具有容受性的子宫以及两者之间的和谐相互作用。胚胎的质量和数量对妊娠的第一步至关重要，胚胎染色体异常是影响早期妊娠建立和维持的重要因素。本研究中所有胚胎质量良好，移植的胚胎阶段和数量相当，且女性年龄小于 35 岁，尽可能排除了干扰因素。子宫内膜的容受性也是影响胚胎植入的重要因素，女性子宫的解剖结构和激素波动对子宫内膜有重要影响，在维持妊娠中发挥关键作用。此外，正常妊娠是一次成功的同种半异体移植，母胎免疫耐受使胚胎能够成功植入并发育至分娩，生殖道微生物群落的变化参与诱导母胎免疫耐受，影响子宫内膜的容受性。

乳酸杆菌是健康女性生殖道微生物群平衡的维持者，它能通过多种方式预防生殖道感染，如产生具有抗菌特性的乳酸，与其他细菌竞争、直接粘附宿主细胞并调节宿主细胞的细胞因子分泌等。一般来说，生殖道微生物群失调，即乳酸杆菌缺失或减少，可能导致不良生殖结局。对于不孕个体，有研究表明，乳酸杆菌主导的生殖道微生物群与 IVF 治疗后的成功妊娠相关。但在本研究中，NP 组和 CP 组乳酸杆菌的相对丰度没有显著差异，这与其他一些研究结果一致，乳酸杆菌对新鲜或冷冻胚胎移植后妊娠结局的影响仍存在争议，需要进一步研究验证。尽管如此，本研究将乳酸杆菌的相对丰度纳入模型后，模型在内部和外部数据上均表现良好，说明乳酸杆菌对 IVF 治疗后的妊娠建立有一定贡献，但不是主要因素，还需考虑其他病原菌的存在。

在建立的预测模型中，嗜盐单胞菌的贡献最大，且与胚胎植入失败显著正相关。嗜盐单胞菌是一类嗜盐细菌，主要应用于生物技术和环境修复领域，随着微生物群研究的进展，在人体微生物群中也发现了它的存在，并与多种疾病相关，在女性生殖道中，它与早期妊娠流产有关，但关于嗜盐单胞菌与女性生殖健康的研究较少。本研究首次指出嗜盐单胞菌可能参与胚胎植入失败，需要进一步大规模研究验证。韦荣球菌是常见于人体口腔、肠道和呼吸道的细菌，与多种疾病相关，在女性生殖道中，它与宫颈上皮内瘤变、子宫内膜异位症等疾病有关，也有研究发现它是 RIF 发展的潜在生物标志物。本研究同样报道了韦荣球菌与胚胎植入失败的关系。阿托波菌是女性生殖道中的常见菌属，以往被认为是细菌性阴道炎和早产的病原菌，但它也存在于正常的女性生殖道微生物群中。在本研究的预测模型中，阿托波菌的存在是胚胎植入成功的保护因素，但阿托波菌丰度异常增加对胚胎植入的潜在负面影响，还需要进一步研究。

本研究也存在一些局限性。首先，样本量相对较小，可能限制研究结果的普遍性；其次，单中心设计无法完全消除选择偏倚；虽然 16S rDNA 全长测序比传统的 16S rRNA 基因测序提供了更全面的信息，但在物种或菌株水平上识别细菌的分辨率仍然有限；研究仅在胚胎移植当天收集宫颈样本，无法评估孕期微生物群的时间变化；此外，没有考虑饮食和生活方式等潜在的混杂因素。未来需要开展大规模、多中心的前瞻性研究来验证这些发现，应用更先进的测序技术，如全基因组鸟枪法宏基因组学，深入了解与妊娠结局相关的生殖微生物群，同时收集更全面的人口统计学、社会经济地位和生活方式信息，更好地控制混杂效应。

总之，本研究初步证明了宫颈微生物群与胚胎植入失败之间的相关性，建立的预测模型包含嗜盐单胞菌、阿托波菌和韦荣球菌的分类以及乳酸杆菌的相对丰度，经外部验证具有一定的泛化能力。这些发现加深了人们对生殖道微生物在接受 IVF-FET 的不孕女性中作用的理解，为 IVF-FET 过程中胚胎移植失败高风险患者的评估和早期干预提供了参考。

材料和方法

1. 研究人群：2021 年 11 月至 2022 年 8 月，共招募 160 名计划在南京医科大学附属苏州医院生殖中心，接受体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI），并进行冻融胚胎移植（FET）治疗的患者。24 名患者因不符合纳入标准被排除。纳入标准包括年龄在 20 - 35 岁之间、首次或第二次 FET 周期、胚胎质量和数量符合特定标准、移植日子宫内膜厚度不小于 7mm、无急性生殖道感染史且过去 2 个月未使用抗生素。排除标准包括严重输卵管积水、III - IV 期子宫内膜异位症或严重子宫腺肌病、未经宫腔镜修复的中重度宫腔粘连、原发性子宫畸形、体重指数（BMI）>30kg/m²、反复自然流产或反复植入失败、自身免疫性疾病、糖尿病、血栓性疾病、抗苗勒管激素 < 1.1ng/mL 等。
2. 样本采集和 DNA 分离：在 FET 当天，擦拭宫颈表面分泌物后，用无菌棉签在宫颈管内轻轻旋转采集宫颈黏液。为防止污染，采样过程中棉签不接触其他部位。样本立即浸入液氮，并迅速运往实验室提取细菌 DNA（使用 Qiagen 公司产品，德国希尔登）。通过定量聚合酶链反应（qPCR）和 16S rDNA 全长测序，对宫颈微生物群进行追踪。
3. 16S rDNA 全长测序：采用 16S 全长组装测序技术（16S-FLAST），其基本原理和方案与之前报道的 16S rDNA 基因全长单分子文库构建一致。所有样本在 NovaSeq 6000 仪器（Illumina 公司）上进行测序，获得约 496.9Gb 数据（17 亿条读数）。根据两侧编码的独特标签，获得 2,014,560 条独特的 16S rRNA 基因序列（>1200bp），其中 5 个样本因序列数低于 1000bp 被排除。通过 FLAST 从测序数据中获得全长 16S rDNA 基因序列，然后在 QIIME2 中使用 vSearch，以 99% 的相似度将这些序列分类为操作分类单元（OTUs），并使用 Mothur v1.42.0，根据参考数据库 Silva_132_SSURef_Nr99 对这些 OTUs 进行注释。
4. 生殖结局测量：非妊娠定义为人绒毛膜促性腺激素（hCG）水平 < 25mIU/mL。
5. 统计分析：分类变量以数字（相对频率 %）表示，连续变量以平均值 ± 标准差（SD）表示。采用学生 t 检验比较组间连续变量的差异，分类变量则采用 χ²检验或 Fisher 精确检验，检验水准为双侧 0.05。对于微生物的相对丰度，采用 Mann - Whitney U 检验，检验水准为双侧 0.05。使用 R 包 vegan 进行 α 和 β 多样性分析，使用 R 包 randomForest 在 NP 组和 CP 组之间建立随机森林模型，利用 R 包 ggplot2 对结果进行可视化和绘制箱线图。使用 SPSS 26.0 构建多变量二元逻辑回归模型，并采用向后逐步回归。使用 R 包 pROC 进行自抽样重复随机抽样，并绘制受试者工作特征曲线（ROC）。}