利用 CPER 技术构建猫冠状病毒反向遗传系统的研究进展

《Microbiology Spectrum 3.7》：Application of versatile reverse genetics system for feline coronavirus

本文利用环化聚合酶延伸反应（CPER）建立猫冠状病毒（FCoV）反向遗传系统，助力 FCoV 研究及药物评估。

　　

猫冠状病毒与猫传染性腹膜炎概述

猫传染性腹膜炎（Feline infectious peritonitis，FIP）是一种由猫冠状病毒（Feline coronavirus，FCoV）引发的致命性疾病。FCoV 感染在猫群中极为普遍，在多猫家庭里，高达 90% 的猫会受到感染，但通常症状轻微或无症状。FCoV 可分为两种致病型：猫肠道冠状病毒（Feline enteric coronavirus，FECV）和高致病性的 FIP 病毒（FIP virus，FIPV）。FECV 致病性较低，一般只会引发无症状感染或轻度肠炎；而 FIPV 则是 FECV 在感染猫体内发生突变产生的，它会导致 FIP。据估计，FCoV 感染的猫中，有 5% - 12% 会发展为 FIP。

FCoV 还可分为两种血清型，即血清型 1（FCoV - 1）和血清型 2（FCoV - 2）。FCoV - 1 在猫群中占主导地位，是猫特有的血清型；FCoV - 2 相对少见，是由血清型 2 犬冠状病毒与 FCoV - 1 重组产生的。从 FECV 转变为 FIPV 与多个基因突变相关，比如 ORF3c、ORF7b 和刺突（Spike，S）基因等。其中，S 蛋白在冠状病毒感染过程中起着关键作用，它由 S1 和 S2 亚基组成，参与受体结合、识别、免疫逃逸和膜融合等过程。S 蛋白在 S1/S2 边界编码一个多碱性切割位点，能被宿主弗林蛋白酶识别，切割后的 S1 和 S2 亚基对于病毒感染十分重要。FIPV 与 FECV 相比，这个切割位点的切割缺陷突变是其最显著的特征。然而，由于缺乏合适的 FCoV 反向遗传系统，目前还无法利用感染性病毒来研究这些氨基酸变化的分子功能。

研究背景与目的

为了深入了解 FCoV 每个突变的功能以及 FECV 向 FIPV 致病型转换的分子机制，构建携带特定突变的重组病毒并研究其病毒学特征至关重要。此前，虽然已经有基于不同载体（如细菌人工染色体载体、痘苗病毒载体和酵母转化相关重组系统）构建的携带 FCoV 全长 cDNA 的感染性克隆，但这些方法存在依赖特定宿主系统、可能引入不需要的突变以及难以快速进行基因修饰等问题。近年来，基于聚合酶链式反应（PCR）的环化聚合酶延伸反应（Circular polymerase extension reaction，CPER）技术在多种 RNA 病毒研究中得到广泛应用。本研究旨在将 CPER 技术应用于 FCoV 研究，构建重组 FCoV，为进一步研究 FCoV 的分子机制和开发抗病毒药物提供有力工具。

基于 CPER 的 FCoV 反向遗传系统的建立

研究人员选用了血清型 1 的 FCoV 菌株 C3663 和血清型 2 的 FCoV 菌株 WSU 79 - 1146 作为亲本病毒。首先，将 FCoV 的基因组划分为 10 个基因片段（F1 至 F10），这些片段覆盖了整个基因组，并且每个片段之间都有至少 13nt 的重叠序列。同时，构建了一个非翻译区（UTR）连接片段，该片段包含 FCoV 3′UTR 的 18nt 序列、丁型肝炎病毒核酶（Hepatitis delta virus ribozyme，HDVr）、牛生长激素（Bovine growth hormone，BGH）多聚 A 信号、巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）启动子以及 FCoV 5′UTR 的 70nt 序列。然后，把这些片段分别克隆到质粒中，通过特异性引物进行扩增，再利用 CPER 技术进行组装。

组装好的 CPER 产物被转染到猫全胚胎 4（Felis catus whole fetus 4，Fcwf - 4）细胞和人胚肾 293T（Human embryonic kidney 293T，HEK293T）细胞的共培养体系中（比例为 4:1）。转染后，在不同时间点收获细胞培养上清液。对于 rFCoV - 1，在转染后 4 天（4 days post - transfection，4 dpt）观察到细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE），收获上清液并在未感染的 Fcwf - 4 细胞中传代，在感染后 3 天（3 days post - infection，3 dpi）观察到 CPE；对于 rFCoV - 2，在 2 dpt 观察到 CPE，收获上清液传代后，1 dpi 观察到 CPE。通过检测病毒抗原的表达，证实了病毒的复制。对第一代重组病毒（P1）进行 RNA 测序，结果显示除了引入的遗传标记外，rFCoVs 与亲本病毒之间的序列差异小于 35%。而且，rFCoVs 与亲本病毒在 Fcwf - 4 细胞中的生长动力学相似，这表明利用 CPER 技术构建的重组病毒在体外的病毒学特征与亲本病毒相近。

编码 FECV - 2 刺突基因的嵌合 FCoV - 2 的构建

为了验证 CPER 方法能否用于构建具有特定修饰的重组 FCoV，研究人员构建了携带 FECV S 蛋白（来自 WSU 79 - 1683 菌株）的 rFCoV - 2。他们将 FECV - 2 的 S 基因替换到 FCoV - 2 的 F8 质粒中，再与其他 FCoV - 2 片段一起进行 CPER 组装，成功拯救出携带 FECV S 蛋白的 rFCoV - 2（rFCoV - 2 1683 - S）。观察发现，rFCoV - 2 1683 - S 在 Fcwf - 4 细胞中的噬菌斑大小与 FCoV - 2 和 rFCoV - 2（均表现为 FIPV 表型）相比更小，但与提供 S 基因的 FECV - 2 相似。这表明通过 CPER 技术能够成功构建携带特定基因修饰的重组 FCoV，并且 S 蛋白对病毒的表型有显著影响。

携带 HiBiT 基因的 rFCoVs 的构建

为了证明利用 CPER 技术构建重组报告病毒的可行性，研究人员在 ORF7b 基因的 N 端插入了源自 NanoLuc 的 HiBiT 标签。通过定点重叠延伸 PCR 技术对 F10 质粒进行改造，扩增出携带 HiBiT 基因的 F10 片段，再与其他片段进行 CPER 组装。成功构建出携带 HiBiT 基因的 rFCoV - 1 HiBiT 和 rFCoV - 2 HiBiT。这些重组病毒在细胞中的生长动力学与亲本病毒相似，并且在感染细胞后，随着时间推移，荧光素酶活性逐渐增加。经过多次传代实验发现，HiBiT 标签在至少 5 次传代后仍能稳定表达，这表明利用 CPER 技术构建的携带 HiBiT 基因的重组 FCoV 具有良好的稳定性。

表达 HiBiT 标签的 rFCoVs 在评估抗病毒抑制剂中的应用

抗病毒药物如核苷类似物 GS - 441524 和病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶抑制剂 EIDD - 1931 已在临床用于 FIP 的治疗。为了验证携带 HiBiT 标签的重组病毒可用于评估抗病毒抑制剂，研究人员用 rFCoV - 1 HiBiT 和 rFCoV - 2 HiBiT 分别感染 Fcwf - 4 细胞，并在感染时加入 GS - 441524 和 EIDD - 1931。结果发现，荧光素酶活性随着药物浓度的增加而呈剂量依赖性降低。通过计算得出，GS - 441524 对 rFCoV - 1 - HiBiT 的半数抑制浓度（IC₅₀）为 0.69μM，EIDD - 1931 为 0.15μM；GS - 441524 对 rFCoV - 2 HiBiT 的 IC₅₀为 0.69μM，EIDD - 1931 为 0.066μM。同时，在检测的药物浓度范围内，未观察到细胞毒性。这表明携带 HiBiT 标签的 rFCoVs 可用于评估抗病毒抑制剂的效果。

研究总结与展望

本研究成功建立了基于 CPER 技术的快速通用 FCoV 反向遗传系统。该系统能够在不影响病毒复制和遗传稳定性的前提下，快速引入所需的修饰或外源短报告基因。利用这个系统，研究人员构建了多种重组 FCoV，包括携带不同 S 基因的嵌合病毒和携带 HiBiT 标签的报告病毒，这些重组病毒在研究 FCoV 的分子机制、评估抗病毒药物等方面具有重要价值。

然而，目前对于 FCoV 的研究仍面临一些挑战。例如，FCoV 的分离较为困难，这使得在 FIP 爆发时难以快速研究病毒的特性，尤其是其 S 蛋白。虽然 CPER 技术在无需获取病毒样本的情况下可对病毒基因进行研究，但还需要进一步优化 FCoV 的细胞培养系统，以更好地应用该技术。此外，随着 FIP 治疗药物的应用，耐药性 FCoV 的出现也成为新的问题，开发具有不同作用机制的有效治疗方法仍然是未来研究的重要方向。

总体而言，本研究建立的反向遗传系统为 FCoV 的分子病毒学研究提供了有力工具，有助于深入探究 FCoV 致病型转换的分子机制、了解病毒的生命周期以及筛选新型抗病毒药物，为控制 FIP 的传播和治疗提供了新的思路和方法。