多重耐药肠炎沙门氏菌阿贡纳血清型在台湾的新挑战：机制、传播与防控

《Microbiology Spectrum 3.7》：Clonal expansion of chromosome-borne CTX-M-55 extended-spectrum β-lactamase-producing Salmonella enterica serovar Agona, Taiwan

本文揭示台湾地区多重耐药（MDR）肠炎沙门氏菌阿贡纳血清型的流行趋势、耐药机制及传播特点。

　　### 多重耐药肠炎沙门氏菌阿贡纳血清型在台湾的新挑战：机制、传播与防控
在生命科学和健康医学领域，细菌耐药性问题一直是全球关注的焦点。肠炎沙门氏菌阿贡纳血清型（Salmonella enterica serovar Agona，简称S. Agona）作为一种常见的食源性致病菌，频繁现身于人类和食用动物之中，与人类健康紧密相连。近年来，台湾地区S. Agona 的耐药情况发生了显著变化，多重耐药（MDR）菌株不断涌现，给公共卫生带来了新的严峻挑战。

1. 研究背景

S. Agona 长期以来在台湾地区人类沙门氏菌病的病原菌中占据一定地位，从 2004 年到 2022 年，它在相关病例中位列第六大常见血清型，同时在鸡肉和猪肉等食品中也时有检出。不过，以往它并非台湾地区耐药性最强的血清型之一。

然而，自 2019 年起，情况开始发生转变。当年，研究人员从一位患者身上先后分离出两株具有广泛耐药性（XDR）的沙门氏菌，经鉴定分别为S. Agona（R19.0144）和S. Goldcoast（R19.0145）。这两株菌对氨苄西林、氯霉素、复方新诺明、氟喹诺酮类以及第三代头孢菌素等多种抗菌药物均产生耐药性。深入的基因组分析发现，它们携带高度相似的 IncHI2 - IncHI2A 质粒，该质粒不仅含有外排泵激活基因ramAp，还携带多达 15 种抗菌药物耐药基因（ARGs），如aac (3)-IId、aadA22、aph(3')-Ia、aph (6)-Id、arr-2、bla_CTX-M-55、bla_LAP-2、bla_TEM-1、dfrA14、floR、lnu(F、qnrS13、sul2、sul3和tet(A 。其中，质粒携带的ramAp可通过增强外排泵活性，使细菌对阿奇霉素、氯霉素、环丙沙星等多种抗菌药物的耐药性显著提升。

2021 年，又有新的发现。从另一位患者身上分离出的两株 XDR S. Agona，其中一株在治疗过程中对厄他培南（一种碳青霉烯类药物）产生耐药性。研究表明，这两株菌的ompC基因存在缺陷，是由一个 160 kb 的 IS15DI 复合转座子插入导致的，该转座子同样携带ramAp和 12 种与 pR18.0877_278 k 中相同的 ARGs。此后，自 2023 年起，MDR S. Agona 的出现呈现出明显的上升趋势。在这样的背景下，深入探究S. Agona 分离株的流行病学趋势、抗菌药物耐药性以及基因组特征迫在眉睫。

2. 材料与方法

为了全面了解S. Agona 的耐药情况，研究人员开展了一系列实验。

• 菌株收集：从 2021 年到 2024 年，研究人员借助台湾疾病监测项目（PulseNet Taiwan），广泛收集来自台湾各地合作医院的人类沙门氏菌病病例中的Salmonella分离株。该研究获得了台湾疾病控制中心机构审查委员会的批准，并豁免了知情同意。所有细菌分离株均通过 MALDI Biotyper（布鲁克公司，美国）重新确认是否为Salmonella，随后按照标准化的 PulseNet 脉冲场凝胶电泳（PFGE）协议进行基因分型，通过与台湾疾病控制中心建立的Salmonella PFGE 数据库对比，确定菌株的血清型。此外，研究还纳入了 2021 年前从人类和动物源收集的 5 株耐扩展 - spectrum 头孢菌素（ESC）的 MDR S. Agona 分离株，用于系统发育分析和耐药机制评估。
• 抗菌药物敏感性测试（AST）：针对 2021 年至 2024 年收集的所有来自人类的S. Agona 分离株，研究人员采用微量肉汤稀释法，使用 Sensititre EUVSEC3 检测板（TREK 诊断系统有限公司，英国西萨塞克斯）测定其最低抑菌浓度（MIC）。检测板涵盖了阿奇霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、美罗培南、萘啶酸、环丙沙星、庆大霉素、氯霉素、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、四环素、粘菌素和替加环素等 14 种抗菌药物。除粘菌素、替加环素和阿奇霉素外，MIC 结果依据临床和实验室标准协会（CLSI）制定的指南进行解读；粘菌素和替加环素的 MIC 结果则参照欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）设定的标准；对于阿奇霉素，依据美国疾病控制与预防中心国家抗菌药物耐药监测系统（CDC NARMS）的标准，MIC≥32 mg/L 判定为耐药，MIC≤16 mg/L 为敏感。同时，环丙沙星非敏感性（NS）包括耐药和中介两种情况，MDR 定义为对至少三类抗菌药物耐药，涵盖大环内酯类（阿奇霉素）、β- 内酰胺类（氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶或美罗培南）、喹诺酮类（萘啶酸或环丙沙星）、氨基糖苷类（庆大霉素）、酚类（氯霉素）、叶酸途径抑制剂（甲氧苄啶和磺胺甲恶唑）、四环素类（四环素）、多粘菌素类（粘菌素）和甘氨酰环素类（替加环素）。
• 全基因组测序（WGS）：研究人员选取了 2015 年至 2024 年间从人类、猪、鸭、鸡和鸡肉中分离出的 72 株耐 ESC 的 MDR S. Agona 分离株进行 WGS，以精准识别耐药决定因素及其相关的遗传载体。测序分别运用 Illumina MiSeq 平台（Illumina 公司，美国加利福尼亚州）和 / 或牛津纳米孔技术（ONT）平台（牛津纳米孔技术有限公司，英国牛津）。Illumina 序列读数使用 SPAdes 3.15.3 版本进行组装，ONT 测序则利用 Dorado v0.5.0 进行碱基识别（采用 dna_r10.4.1_e8.2_400bps_sup@4.3.0 模型），并使用 Flye v2.9.2 进行染色体组装，质粒组装借助 Plassembler v1.6.0 完成，序列优化使用 Medaka v1.11.3（采用 r1041_e82_400bps_sup_v4.3.0 模型）。对于同时在 Illumina 和 ONT 平台测序的分离株，利用 Polypolish v0.6.0 和 Pypolca v0.3.0 使用 Illumina 读数对纳米孔组装结果进行优化，以提高基因组序列的准确性。
• 聚合酶链反应（PCR）：PCR 技术被用于检测ramAp、bla_CTX-M的第 1 组（包括bla_CTX-M-55）、IncHI2 和 IncHI2A 复制子，以及S. Agona 抗性基因组岛_11（RGI_SA11）的插入情况，具体引物信息列于相关表格中。
• WGS 数据分析：研究人员借助 NCBI 数据库提供的 AMRFinderPlus 流程，以及基因组流行病学中心提供的 ResFinder 和 PlasmidFinder 工具，从每个分离株的组装重叠群中确定抗菌药物耐药基因、耐药相关突变、传统序列类型（STs）和质粒不相容性（Inc）类型。
• 构建 PFGE 树状图：运用 BioNumerics 6.6 版本提供的工具，通过对S. Agona 分离株的 PFGE 模式进行聚类分析，评估它们之间的遗传关系。采用 Dice 相似系数衡量两个 PFGE 模式之间的相似性，最终利用非加权组平均法（UPGMA）算法生成树状图，优化设置为 1.5%，容差为 0.75%。
• 质粒遗传图谱比较：研究人员使用 Easyfig 软件对 pR18.0246_278 k（来自S. Agona R18.0246）、pR18.0877_278 k（来自S. Goldcoast R18.0877）、pR19.0144_302 k（来自S. Agona R19.0144）和 pR19.0145_278 k（来自S. Goldcoast R19.0145）的遗传图谱进行比较，在图谱中，抗菌药物耐药基因和ramAp用红色突出显示，插入序列 IS26 或其变体 IS15DI 用绿色标记。
• IncHI2 - IncHI2A 质粒的遗传相关性分析：为探究与S. Agona R18.0246 的 pR18.0246_278 k 相关的 IncHI2 - IncHI2A 质粒的分布情况，研究人员利用ramAp的核苷酸序列在 NCBI 核苷酸数据库中通过 BLAST 工具进行检索，获取包含ramAp序列的条目，并挑选质粒进一步分析其不相容性类型和相关抗菌药物耐药基因。将携带 IncHI2 - IncHI2A 复制子和bla_CTX-M-55的质粒纳入系统发育分析，使用 Mash 计算质粒之间的成对距离，并运用单连锁算法构建系统发育树。将与 pR18.0246_278 k 成对距离小于 0.006 的质粒展示在相关图中，以体现这些质粒之间紧密的遗传关系，相关质粒的详细信息，如遗传特征和相关耐药基因，总结在相应表格中。
• 耐 ESC S. Agona 分离株的系统发育分析：运用核心基因组单核苷酸多态性（cgSNP）图谱对 72 株耐 ESC 的S. Agona 分离株进行系统发育分析。cgSNP 图谱借助 ska.rust v0.3.7 采用无参考方法生成，系统发育推断使用 IQ-TREE v2.2.2 中的最大似然法进行，最终生成的系统发育树利用 iTOL 进行可视化展示。
• RGI_SAs 和 RGI_SA11 变体的比较：以S. Agona R18.0246 的 pR18.0246_278 k 序列为参考，运用 BLAST Ring Image Generator（BRIG）流程对 11 种S. Agona 抗性基因组岛（RGI_SAs）和 8 种 RGI_SA11 变体进行比较。

3. 结果与讨论

研究人员通过监测数据发现，在 2021 年至 2024 年期间，S. Agona 成为人类沙门氏菌病中第三大常见血清型，占病例总数的 6.2%（360/5,783），仅次于S. Enteritidis（42.2%）和S. Typhimurium（21.1%）。值得注意的是，2024 年S. Agona 的分离率大幅上升至 10.7%。

抗菌药物敏感性测试结果显示，2023 年和 2024 年收集的分离株耐药率极高。这些分离株对氨苄西林、ESC（如头孢噻肟和头孢他啶）、萘啶酸、环丙沙星、庆大霉素、氯霉素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑、四环素和替加环素等药物的耐药率在 22.8% - 48.6% 之间。而且，MDR S. Agona 分离株的比例从 2022 年的 11.8% 急剧上升至 2024 年的 72.0%，总体患病率达到 40.8%。PFGE 模式聚类分析表明，耐 ESC 的 MDR S. Agona 分离株被分为五个不同的簇，同时有少数分离株分散在树状图中，这充分表明这些菌株具有显著的遗传多样性。

对 72 株耐 ESC 的 MDR S. Agona 分离株进行 WGS 和基因组分析后发现，所有S. Agona 分离株均属于 ST13 型，且在染色体中携带fosA7.2基因。在这 72 株分离株中，66 株携带ramAp基因，70 株携带bla_CTX-M-55基因。携带bla_CTX-M-55的分离株除了fosA7.2基因外，还携带多达 15 种 ARGs，这些基因要么位于 IncHI2 - IncHI2A 质粒上，要么存在于染色体区域中。

进一步分析发现，在 70 株携带bla_CTX-M-55的分离株中，24 株的 ARGs 位于 IncHI2 - IncHI2A 质粒上。这种携带 15 种 ARGs 的 IncHI2 - IncHI2A 质粒最早于 2018 年在一位患者的S. Agona 分离株（R18.0246）中被发现，随后在猪、鸭、鸡和鸡肉等来源的分离株中也相继被检测到。S. Agona R18.0246 的质粒 pR18.0246_278 k（登录号 CP093412.1）与S. Goldcoast 分离株 R18.0877 和 R19.0145 的质粒序列几乎完全相同，分别仅相差 7 个和 9 个碱基。追溯研究发现，从 NCBI 数据库中检索到的携带ramAp和bla_CTX-M-55的 IncHI2 - IncHI2A 质粒，不仅存在于多种Salmonella血清型中，如 Agona、Goldcoast、Kentucky、London、Paratyphi B 和 Saintpaul，还存在于一些肠杆菌科物种中，包括Shigella dysenteriae、Escherichia coli、E. albertii、Enterobacter cloacae、Enterobacter hormaechei和Enterobacter roggenkampii 。这些质粒携带的上述 15 种 ARGs 数量各不相同，部分还携带额外的 ARGs。S. Agona R18.0246 的质粒与来自台湾和中国的S. Goldcoast 和S. Paratyphi B 分离株中的质粒在遗传上高度相似。

而在 70 株携带bla_CTX-M-55的分离株中，有 46 株的 IncHI2 - IncHI2A 质粒相关 ARGs 整合到了染色体上，这些被称为S. Agona 抗性基因组岛（RGI_SAs）的结构，经鉴定为被 IS26 或其变体 IS15DI 侧翼的复合转座子。通过分析染色体插入位点，研究人员共识别出 11 种 RGI_SAs，但有 5 株分离株的插入位点无法确定，推测可能是由于基因组岛的进一步重排所致。序列比较结果显示，这些 RGI_SAs 很可能起源于 IncHI2 - IncHI2A 质粒。其中，最常见的基因组岛 RGI_SA11 插入到了编码 LysR 家族转录调节因子的基因中，另一个基因组岛 RGI_SA6 则插入到ompC基因中，在 6 株来自人类和一只鸭子的分离株中被发现。

系统发育分析结果显示，72 株耐 ESC 的分离株聚类为两个不同的遗传谱系。携带 IncHI2 - IncHI2A 质粒的分离株表现出显著的多样性，这意味着质粒携带的 ARGs 可能通过质粒结合在Salmonella菌株之间频繁进行水平转移。相比之下，具有相同 RGI 类型的分离株遗传关系更为紧密，这表明在获得 RGI 后发生了克隆扩增。值得一提的是，RGI_SA11 已经分化出多种变体，其序列长度和携带的 ARGs 数量均有所不同。

研究人员通过 PCR 检测了缺乏 WGS 数据的分离株中ramAp、bla_CTX-M-55、IncHI2 - IncHI2A 复制子和 RGI_SA11 插入的情况，以此评估 2021 年至 2024 年新出现的 MDR S. Agona 的流行情况。综合 WGS 和 PCR 分析结果，发现 41.3%（149/360）的S. Agona 分离株属于新出现的 MDR 菌株，且在 2023 年和 2024 年其流行率显著上升。在 2024 年收集的S. Agona 分离株中，这些 MDR 菌株占比高达 74.4%。在 360 株分离株中，30 株（8.3%）的 ARGs 位于 IncHI2 - IncHI2A 质粒上，其流行率从 2021 年的 14.2% 下降至 2024 年的 3.2%。此外，119 株（33.1%）分离株的染色体中携带 ARGs，其中 92 株<