猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP2a 关键氨基酸替换在病毒感染中的关键作用及疫苗开发意义

《Journal of Virology 4.0》：The GP2a 91/97/98 amino acid substitutions play critical roles in determining PRRSV tropism and infectivity but do not affect immune responses

【字体：大中小】 时间：2025年03月21日 来源：Journal of Virology 4.0

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　　本文首次发现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP2a 中 91/97/98 位氨基酸替换对 Marc-145 细胞适应性等有重要影响。

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　　### 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展：GP2a 氨基酸替换的关键作用及疫苗开发意义
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是全球养猪业中极具经济影响力的传染病，每年给全球养猪产业造成约 27 亿美元的损失。该疾病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起，可导致母猪繁殖障碍和各年龄段猪的呼吸窘迫综合征。PRRSV 是一种包膜单链正链 RNA 病毒，基因组约 15kb，包含至少 10 个开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs），编码多种结构和非结构蛋白。目前，PRRSV 分为 PRRSV

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-1 和 PRRSV-2 两个种，在中国，PRRSV-2 分离株是猪群中的主要流行毒株。

尽管 PRRSV 分离株遗传多样性高，但它们的宿主和细胞嗜性较为局限。猪是 PRRSV 的唯一自然宿主，在体内，只有巨噬细胞和单核细胞谱系的特定细胞对 PRRSV 易感；在体外，MA104、CL2621 和 Marc-145 等细胞可用于 PRRSV 的增殖。其中，Marc-145 细胞是 PRRSV 分离和疫苗开发中最常用的细胞系，但越来越多的 PRRSV 分离株无法感染 Marc-145 细胞，确定 PRRSV 对 Marc-145 细胞嗜性的关键决定因素对疫苗开发具有重要意义。

在本研究中，科研人员通过构建基于 NADC34-like PRRSV-2、NADC30-like PRRSV-2、HP-PRRSV-2 和 PRRSV-1 感染性克隆的嵌合病毒，探索了 PRRSV 对 Marc-145 细胞嗜性的关键决定因素。研究结果为 PRRSV 嗜性和感染性提供了新的见解，对 PRRS 疫苗开发也具有重要的指导意义。

1. 目前流行的 PRRSV 分离株表现出不同的 Marc-145 细胞嗜性

研究人员首先测定了当前流行的 PRRSV-2 分离株（NADC34-like BJ1805-2 株、NADC30-like SD17-38 株和 HP-PRRSV-2 XJ17-5 株）的体外细胞嗜性。结果发现，猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages，PAMs）对这些分离株均易感，但产生的病毒滴度不同，其中 NADC34-like BJ1805-2 在 PAMs 中的复制效率最高。而 Marc-145 细胞仅对 XJ17-5 分离株易感，对 SD17-38 和 BJ1805-2 菌株不敏感。通过蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）、免疫荧光分析（Immunofluorescence Assay，IFA）、细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）观察和噬斑检测等实验，进一步证实了 HP-PRRSV-2 XJ17-5 分离株具有 Marc-145 细胞适应性，而 NADC34-like BJ1805-2 和 NADC30-like SD17-38 菌株则不具有。

2. GP2a 中 91/97/98 位氨基酸替换是 NADC34-like 和 NADC30-like PRRSV-2 适应 Marc-145 细胞的充分必要决定因素

为探究 PRRSV 对 Marc-145 细胞嗜性的关键决定因素，研究人员构建了 NADC34-like PRRSV-2 BJ1805-2 和 HP-PRRSV-2 XJ17-5 的感染性克隆（rBJ1805-2 和 rXJ17-5）。先前研究表明，ORFs 2 - 4 基因编码的次要包膜蛋白是 PRRSV 嗜性的主要决定因素，因此研究人员构建了交换 rXJ17-5 和 rBJ1805-2 感染性克隆中 ORFs 2 - 4 基因的嵌合病毒。IFA 结果显示，含有 rXJ17-5 的 ORFs 2 - 4 的嵌合 rBJ1805-2 病毒（rBTX234）获得了 Marc-145 细胞适应性，而含有 rBJ1805-2 的 ORFs 2 - 4 的嵌合 rXJ17-5 病毒（rXTB234）则失去了 Marc-145 细胞适应性，证实了次要包膜蛋白是 NADC34-like rBJ1805-2 菌株 Marc-145 细胞嗜性的决定因素。

随后，研究人员构建了一系列含有 rXJ17-5 中一个或两个次要包膜蛋白编码基因的嵌合 rBJ1805-2 病毒，发现含有 rXJ17-5 的 ORF2 基因的三个嵌合病毒（rBTX2、rBTX23 和 rBTX24）获得了 Marc-145 细胞适应性，表明 ORF2 基因编码的 GP2a 是 rBJ1805-2 病毒 Marc-145 细胞适应性的关键决定因素。进一步构建含有片段替换的嵌合病毒，确定了 GP2a 89 - 98 位氨基酸是决定区域，该区域存在 91/97/98 位氨基酸的三个保守替换。将 rBJ1805-2 病毒中 GP2a 91/97/98 位氨基酸的 “TMF” 模式替换为 “VVL” 模式后，病毒（rBJ-VVL）获得了 Marc-145 细胞嗜性，且将含有 “VVL” 模式的 Marc-145 适应性嵌合病毒中这三个氨基酸突变回 “TMF” 模式后，病毒失去了 Marc-145 细胞适应性，表明 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换是 NADC34-like PRRSV-2 rBJ1805-2 菌株 Marc-145 细胞适应性的充分必要决定因素。

由于 NADC34-like PRRSV-2 和 NADC30-like PRRSV-2 都属于谱系 1 PRRSV-2，研究人员进一步评估了 GP2a 91/97/98 位氨基酸模式对 NADC30-like rSD17-38 感染性克隆 Marc-145 细胞适应性的影响。结果表明，含有 rXJ17-5 的 ORFs 2 - 4 的嵌合 rSD17-38 病毒（rSTX234）和仅含有 GP2a 91/97/98 “VVL” 替换的突变 rSD17-38 病毒（rSD-VVL）都获得了 Marc-145 细胞适应性，且含有两个替换的突变病毒不能感染 Marc-145 细胞，将 rSTX234 中 GP2a 91/97/98 位氨基酸突变回 “TMF” 模式后，病毒失去了 Marc-145 细胞嗜性，说明 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换也是 NADC30-like rSD17-38 菌株 Marc-145 细胞嗜性的充分必要决定因素。

3. GP2a 中 91/97/98 位氨基酸替换是 HP-PRRSV-2 适应 Marc-145 细胞的充分但非必要决定因素

虽然含有 rBJ1805-2 的 ORFs 2 - 4 的嵌合 HP-PRRSV-2 rXJ17-5（rXTB234）失去了 Marc-145 细胞适应性，但当将 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换恢复为 “VVL” 时，突变的嵌合病毒（rXTB234-VVL）又获得了 Marc-145 细胞适应性，说明 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换是 HP-PRRSV-2 rXJ17-5 菌株 Marc-145 细胞适应性的充分决定因素。然而，仅含有 “TMF” 模式的突变 rXJ17-5 菌株（rXJ-TMF）仍然保持 Marc-145 细胞嗜性，表明该氨基酸替换不是 HP-PRRSV-2 Marc-145 细胞适应性的必要决定因素。

除次要包膜蛋白外，主要包膜蛋白（GP5 和 M）和 nsp2 也被报道与 PRRSV 嗜性有关。研究人员评估了它们对 HP-PRRSV-2 Marc-145 细胞嗜性的影响，发现含有 Marc-145 非适应性菌株（rBJ1805-2）的 GP5 和 M 编码基因的嵌合病毒（rXTB-TMF-56）仍能感染 Marc-145 细胞，说明主要包膜蛋白对 Marc-145 细胞适应性不是关键因素；而含有 rBJ1805-2 的 nsp2 编码基因的嵌合病毒（rXTB-TMF-nsp2）无法拯救。

基于含有 GP2a 91/97/98 “TMF” 模式的突变 rXJ17-5 菌株（rXJ-TMF），研究人员构建了一系列嵌合病毒来寻找 HP-PRRSV-2 中 Marc-145 细胞适应性的其他充分决定因素。结果发现，GP2a-GP3（不包括 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换和 GP3-GP4 重叠区域）和 GP3-GP4 区域是 HP-PRRSV-2 中 Marc-145 细胞适应性的另外两个充分决定因素。

4. GP2a 中 91/97/98 位氨基酸替换是 PRRSV-1 适应 Marc-145 细胞的必要但非充分决定因素

PRRSV-2 中 GP2a 91/97/98 位氨基酸在 PRRSV-1 中的对应位置是 GP2a 88/94/95 位氨基酸，已有研究表明它们与 PRRSV-1 在 Marc-145 细胞中的适应性有关。为验证这些氨基酸替换是否是转换 Marc-145 细胞适应性的充分决定因素，研究人员在 Marc-145 非适应性 PRRSV-1 菌株（rHLJB1）中进行了评估。研究人员将 rHLJB1 菌株中的 ORF2 - ORF3 基因（包括 ORF3 - ORF4 重叠区域）替换为 Amervac 疫苗株的相应基因，构建了嵌合病毒 rHTA23，发现 rHTA23 获得了 Marc-145 细胞嗜性。但将 rHLJB1 中 GP2a 的 “IMF” 模式突变为 “FIL” 模式后生成的 rHLJB1-FIL 并未获得 Marc-145 细胞适应性，表明 PRRSV-1 中 GP2a 的三重氨基酸替换不是 Marc-145 细胞适应性的充分决定因素。

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研究人员进一步构建了另外两个含有 Amervac 株 ORF2 和 ORF3 的嵌合 rHLJB1 病毒（rHTA2 和 rHTA3），它们均不能适应 Marc-145 细胞。而含有 GP2a “FIL” 模式和 Amervac 株 GP3 的嵌合病毒（rHTA-FIL-3）获得了 Marc-145 细胞嗜性。继续构建含有 GP2a “FIL” 模式和 Amervac 株 GP3 不同片段的嵌合病毒，发现 rHTA-FIL-3–182-270aa 病毒获得了 Marc-145 细胞适应性，而 rHTA-FIL-3-1-181aa 则没有，表明 GP2a 三重氨基酸替换与 GP3-GP4 重叠区域结合是 PRRSV-1 中 Marc-145 细胞嗜性的充分决定因素。

5. PRRSV-1 和 PRRSV-2 之间 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换对 Marc-145 细胞适应性的影响

研究人员基于两个 Marc-145 非适应性 PRRSV-2 感染性克隆（rBJ1805-2 和 rSD17-38），构建了含有 Marc-145 适应性 PRRSV-1 株（Amervac）GP2a “FIL” 模式的突变病毒（rBJ-FIL 和 rSD-FIL），发现这两个突变病毒都获得了 Marc-145 细胞嗜性，表明来自 Marc-145 适应性 PRRSV-1 株的 GP2a 三重氨基酸替换足以转换谱系 1 PRRSV-2 分离株的 Marc-145 细胞嗜性。

相反，构建的含有 Marc-145 适应性 PRRSV-2 株（rXJ17-5）GP2a 91/97/98 “VVL” 模式的突变 PRRSV-1 株（rHLJB1-VVL）仍然不能感染 Marc-145 细胞。由于 PRRSV-1 和 PRRSV-2 中 GP3-GP4 重叠区域大小不一致，研究人员未进一步构建含有 PRRSV-2 的 GP2a “VVL” 替换和 GP3-GP4 重叠区域的嵌合 PRRSV-1 病毒。这些结果与上述发现一致，即 GP2a 三重氨基酸替换是谱系 1 PRRSV-2 分离株 Marc-145 细胞适应性的充分决定因素，但不是 PRRSV-1 菌株的充分决定因素。

6. PRRSV 分离株中 GP2a 91/97/98 位氨基酸模式高度多样

考虑到 GP2a 91/97/98 位氨基酸模式对 PRRSV 嗜性的关键影响，研究人员通过生物信息学分析评估了 PRRSV-1 和 PRRSV-2 中这些氨基酸的遗传多样性。结果发现，GP2a 91/97/98 位氨基酸模式在 PRRSV-1 和 PRRSV-2 中都高度多样，“FMF”、“VMF” 和 “IMF” 是 PRRSV-1 中的三种主要模式，“VVL”、“TMF” 和 “TML” 是 PRRSV-2 中的三种主要模式。

回顾性分析发现，具有 GP2a “FIL” 模式的 PRRSV-1 GZ11-G1 和 Amervac 菌株是 Marc-145 适应性的，而具有 “IM/TMF” 模式的 HLJB-1 和 BJEU06-1 分离株是非适应性的；具有 GP2a “VVL” 模式的 NADC30-like 重组体和 HP-PRRSV-2 分离株是 Marc-145 适应性的，而具有 “TMF” 模式的谱系 1 PRRSV-2 分离株是非适应性的，这些结果与本研究中嵌合病毒的结果一致。

7. GP2a 91/97/98 位氨基酸替换也影响 PRRSV 对 PAMs 的感染性

Marc-145 非适应性的 BJ1805-2 分离株在 PAMs 中的复制效率明显高于 Marc-145 适应性的 XJ17-5 分离株。为分析 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换是否在 PRRSV 对 PAMs 的感染性中起作用，研究人员比较了亲本 rBJ1805-2 和两个突变病毒（rBJ-VVL 和 rBJ-FIL）在 PAMs 中的复制效率。WB 结果显示，rBJ1805-2 感染的 PAMs 中检测到的 N 蛋白量高于 rBJ-VVL 和 rBJ-FIL 感染的 PAMs；IFA 检测也表明，突变病毒的感染效率明显低于亲本病毒和反向突变病毒，验证了 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换影响 PRRSV 对 PAMs 的感染性。

8. GP2a 91/97/98 位氨基酸替换影响 PRRSV 在仔猪中的感染性，但不影响免疫反应

为进一步研究 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换对 PRRSV 体内感染性的影响，研究人员进行了仔猪接种实验。将 20 只 4 周龄 PRRSV 阴性健康仔猪分为四组，两组分别接种 rBJ1805-2 和 rBJ-VVL，另外两组接种 DMEM 作为阴性对照。结果发现，rBJ1805-2 感染的仔猪在 7 - 10 天出现发热，rBJ-VVL 感染的仔猪未出现发热，且 rBJ1805-2 感染仔猪的病毒血症在 5 - 14 天明显高于 rBJ-VVL 感染仔猪，表明 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换影响 NADC34-like PRRSV-2 在仔猪中的感染性。

在 43 天，对部分仔猪用另一种 NADC34-like SDLY23-1742 分离株进行攻毒实验。结果显示，rBJ1805-2 和 rBJ-VVL 接种的仔猪在攻毒后病毒血症、肺部病毒载量和病理损伤均明显低于 SDLY23-1742 攻毒的仔猪，且两者提供的保护水平相似。检测体液免疫反应发现，rBJ1805-2 和 rBJ-VVL 诱导的中和抗体（neutralizing antibodies，nAbs）水平、T 滤泡辅助细胞（T follicular helper cells，Tfh）百分比在两组之间无显著差异；检测细胞免疫反应发现，两组诱导的 PRRSV 特异性 IFN-γ 分泌细胞（IFN-γ-SC）水平也无显著差异，表明 GP2a 91/97/98 位氨基酸替换不显著影响免疫反应。