薄层琼脂（TLA）：耐药结核病检测的新希望

《Journal of Clinical Microbiology》：Direct thin-layer agar for bedaquiline-susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis at BSL2 level yields high accuracy in 15 days from sputum processing

本文验证了 TLA 用于间接检测贝达喹啉（BDQ）最低抑菌浓度及直接药敏试验的性能，为耐药结核病检测提供新方案。

　　### 引言
耐药结核病（TB）的治疗面临诸多挑战，其中药物敏感性检测（DST）对于优化多药耐药结核病（MDR-TB）患者的治疗至关重要。自 2020 年起，世界卫生组织（WHO）将贝达喹啉（BDQ）纳入 MDR-TB 治疗方案的核心药物。BDQ 是一种二芳基喹啉类抗分枝杆菌化合物，通过阻断 ATP 合成发挥杀菌作用。然而，BDQ 耐药率逐渐上升，包括在初治 TB 患者中，这对治疗方案的有效性构成威胁。

目前，BDQ 耐药检测存在诸多困难。表型检测需要生物安全三级（BSL3）实验室，而基因型检测因多种突变与表型耐药的相关性不完善，尚未转化为快速分子检测。因此，表型 DST（pDST）仍是指导治疗和监测 BDQ 耐药的参考方法。但现有的 pDST 方法，如基于 Middlebrook 7H10 或 7H11 琼脂的最低抑菌浓度（MIC）测定和 7H9 肉汤微量稀释法（BMD），存在诸多局限性，如耗时久，需 3 - 4 周才能出结果，且固体培养基法受 BDQ 与聚丙烯强结合的限制，仅能使用聚苯乙烯管。液体培养法虽敏感性高、周转时间快，但同样需要 BSL3 实验室条件，限制了其在基层的应用。

薄层琼脂（TLA）为结核病检测提供了新的可能。它操作简单、成本较低，可直接从痰液样本中分离结核分枝杆菌（MTB）并检测耐药性。TLA 在 MTB 分离及检测利福平（RIF）和异烟肼（INH）耐药性方面，与传统方法（如 MGIT 系统）表现相当。且 TLA 的一步法操作，将处理后的痰液样本直接接种到固体培养板上，整个过程无需重新打开培养板，降低了气溶胶化和泄漏风险，适用于中等风险（生物安全二级，BSL2）实验室。不过，此前 TLA 用于 BDQ 检测的相关研究较少。本研究旨在验证 TLA 作为间接检测 BDQ - MIC 的方法，并评估其在直接检测 MTB 分离及 BDQ、RIF、INH 和左氧氟沙星（LFX）pDST 中的性能。

材料与方法

间接 TLA - BDQ - MIC 验证

研究选取了 21 株临床 MTB 分离株和 10 株体外筛选的菌株，这些菌株来自比利时安特卫普热带医学研究所（ITM）的菌株库，涵盖了广泛的 MIC 值范围。其中，21 株临床分离株中有 18 株可获取全基因组测序（WGS）数据，这些菌株中，15 株 atpE 基因野生型，3 株 Rv0678 基因存在突变。10 株体外筛选菌株中，4 株 atpE 基因突变，6 株 Rv0687 基因突变。实验还纳入 MTB H37Rv 参考菌株作为 BDQ 敏感对照菌株。所有菌株在测试前均在改良罗氏（L?wenstein - Jensen，LJ）培养基上新鲜传代培养。

实验时，将在 LJ 培养基上新鲜生长的 MTB 制备成细菌悬液，调整浊度至麦氏标准 1 号，再用无菌蒸馏水 1:10 稀释。使用无菌移液管，向自制 TLA 板（Corning Costar 3513；Sigma - Aldrich，美国）的 12 个孔（除阴性对照孔外）各接种一滴（约 50 μL）菌液。由两名操作人员分别独立进行接种，且每次接种使用不同的细菌悬液，每个菌株共接种 4 个重复。TLA 板上设有生长对照（GC）孔、对硝基苯甲酸（PNB，500 μg/mL，用于区分 MTB 复合群和非结核分枝杆菌）孔、阴性对照孔，以及不同浓度 BDQ（0.008、0.015、0.03、0.06、0.125、0.25、0.5、1 和 2 μg/mL）的孔。BDQ 粉末购自比利时杨森制药公司（Janssen Pharmaceuticals），批号 16175328。TLA 板的培养基是将 Middlebrook 7H11 琼脂基础（Becton Dickinson，美国）与 86% - 89% 甘油、无菌蒸馏水按制造商说明混合，高压灭菌冷却至 55°C 后，添加油酸葡萄糖过氧化氢酶（OADC，Becton Dickinson）和浓度均为 4 μg/mL 的两性霉素、哌拉西林、甲氧苄啶等抗生素。同时，在聚苯乙烯管中以相同 BDQ 浓度，使用添加 OAD 补充剂的 7H11 琼脂培养基进行平行 MIC 测定。接种后，TLA 板分别置于 34°C - 38°C、环境 CO?浓度或补充 5% - 10% CO?的培养箱中培养，而 7H11 琼脂培养基管始终在 5% - 10% CO?环境下培养。TLA 板在培养第 7 天（D7）和第 14 天（D14）由两名独立操作人员使用常规光学显微镜（10 倍物镜）观察读数。当 GC 孔有生长且 PNB 孔无生长时，判定为 MTB 阳性。若 GC 孔至少有 10 个菌落，则可进行 MIC 结果判读，MIC 值为无细菌生长（即 100% 抑制）的最低药物浓度。7H11 琼脂培养基管的 MIC 检测在 4 周后读数，MIC₉₉定义为生长量少于 1/100 稀释 GC 管的最高药物浓度。

直接痰液 TLA - DST

研究收集了 2021 年 12 月至 2023 年 12 月在卢旺达 Kabutare 的 MDR - TB 诊所登记、经 GeneXpert MTB/RIF（Ultra）检测确诊为利福平耐药肺结核（RR - TB）且同意参与研究的患者痰液样本。每位患者在开始 RR - TB 治疗前收集 3 份痰液样本：第 1 份为就诊当天的即时样本，第 2 份为过夜收集的样本，第 3 份为次日的即时样本。所有样本在第 3 份样本采集当天，使用维持在 4°C 左右的冷藏箱送至卢旺达基加利国家参考实验室（NRL）进行基因分型和表型检测。为降低污染风险，样本送达后立即处理。样本经 NaOH - Nalc 去污处理后进行金胺 O 染色显微镜检查。其中，样本 2 用于自制 LJ 培养基和自动化 MGIT 系统的初次培养，样本 3 用于二次初次培养（LJ 和 MGIT）及平行的直接 TLA - DST 检测。为确保方法间的一致性和可比性，仅将样本 3 的结果用于分析 LJ、MGIT 和 TLA 方法的污染情况和检测性能，通过匹配样本 ID 来对齐数据集。三份样本的剩余沉积物保存于 - 20°C。LJ 或 MGIT 培养阳性样本后续进行 pDST，2022 年 10 月前采用 1% 比例法在 LJ 培养基上检测一线抗结核药物，之后采用 MGIT - DST 检测包括一线药物、BDQ 和 LFX。

直接 TLA 检测使用与间接检测相同的 12 孔板（Corning Costar 3513；Sigma - Aldrich，美国）和添加广谱抗生素混合物（OADC、两性霉素、哌拉西林、甲氧苄啶）的 7H11 琼脂培养基，以抑制污染。部分 TLA 板还添加了氧化还原指示剂 2,3 - 二苯基 - 5 -（2 - 噻吩基）氯化四氮唑（STC，Merck，美国），终浓度为 50 μg/mL，在培养基冷却后加入，以方便观察早期生长情况。为保证自制 TLA 板质量，每次制备的板都接种 H37Rv 和偶然分枝杆菌进行质量控制。每个 12 孔板可容纳 2 个样本，每个样本设有无药 GC 孔、PNB（500 μg/mL）孔、RIF（1.0 μg/mL）孔、INH（0.2 μg/mL）孔、LFX（1.0 μg/mL）孔和 BDQ（0.25 μg/mL）孔。处理后的痰液沉积物重悬于 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，用无菌移液管向每个 TLA 孔接种约 50 μL（一滴）重悬样本。TLA 板在 34°C - 38°C、CO?富集环境（使用烛缸法营造）中培养，分别在第 7、14、21、28 和 35 天（若时间有偏差，则在最近的可行日期）不开盖进行肉眼观察。2023 年 5 月起，TLA 板在标准培养条件下（不补充 CO?）培养。结果在 GC 孔出现阳性时判读，PNB 孔无生长判定为 MTB 阳性，含药孔有生长则表示耐药。若直接 TLA - DST 与 LJ 或 MGIT 上的间接 DST 药物检测结果存在差异，则通过基因测序解决。对送至比利时安特卫普热带医学研究所的剩余痰液或沉积物样本（第 2 或第 3 份样本）进行 rpoB 基因的桑格测序。此外，还对 katG 和 fabG - inhA 基因进行测序以评估 INH 耐药性。使用 Illumina HiSeq 平台（CD Genomics，美国）对分离株提取的基因组 DNA 进行全基因组测序（WGS），进一步解决 INH、LVX 和 BDQ 检测结果的差异。若测序数据无法解决差异，则以间接 pDST 结果为准。

统计分析

采用卡方检验（Yates 连续性校正）比较不同培养环境和读数时间下 TLA - BDQ - MIC 结果的准确性。使用 Z 检验评估比例差异，比较标准培养箱第 7 天读数与其他条件下结果可靠性的差异。直接 TLA - DST 的 MTB 阳性率通过阳性样本数除以总检测样本数计算。以 LJ 结果为基线，使用 Fisher 精确检验和 Mantel - Haenszel 卡方检验比较直接 TLA 方法不同条件下的结果。通过匹配样本 ID，使用 Z 比例法比较 TLA 与 LJ 或 MGIT 的结果，并采用 Bonferroni 事后校正进行多重比较。以 LJ 和 MGIT 为参考标准，根据数据可用性计算 TLA 检测 RIF、INH、LFX 和 BDQ 耐药性的敏感性、特异性及相应的 95% 置信区间（CI）。所有统计分析均使用 R 软件（4.1.0 版本）进行，设定显著性水平为 0.05。

结果

间接 TLA - BDQ - MIC 验证

H37Rv 菌株在 5% - 10% CO?培养条件下，BDQ - MIC 值略有升高，众数为 0.125 μg/mL，范围在 0.060 - 0.125 μg/mL；而在标准培养条件下，众数为 0.060 μg/mL，范围在 0.030 - 0.125 μg/mL。两种培养环境下，D14 读数的 MIC 值均高于 D7。在标准培养箱 D7 读数时，112 个 H37Rv 重复样本中仅 1 个板出现污染，污染率为 0.9%（1/112）。

对于 21 株临床分离株和 10 株体外耐药菌株，TLA - BDQ - MIC 测定结果受培养环境和读数时间影响。标准培养箱中 D7 读数的结果与 7H11 管法参考检测相比，准确性显著更高（卡方值 = 4.54，P = 0.033）；D14 读数时，标准培养箱结果准确性同样显著高于 5% - 10% CO?培养箱（卡方值 = 20.57，P < 0.001）。这表明标准培养箱和 D7 读数可提高 TLA - BDQ - MIC 结果的可靠性（Z = 2.38，P = 0.017）。在 248 个 TLA 板中，D7 仅有 1 个板（0.40%）、D14 有 3 个板（1.21%）出现部分污染，导致 MIC 结果无法判读。

在标准培养和 D7 读数的最佳条件下，TLA 能正确识别所有野生型临床菌株对 BDQ 敏感。10 株 BDQ 耐药菌株中，9 株通过 TLA 检测出 MIC 升高，准确被检测到。但携带 Rv0678 未知意义突变的 1 株菌株，其中位 MIC 分布与 WHO 提议的 BDQ 临界浓度（中位数 [95% CI]：0.25 [0.125 - 0.5]）一致。

直接 TLA - DST

2021 年 12 月至 2023 年 12 月，卢旺达 NRL 共收到 143 份来自全国经当地医疗机构 GeneXpert 检测确诊为 RR - TB 患者的痰液样本。治疗前，TLA、LJ 和 MGIT 的总体培养阳性率分别为 53.8%（77/143）、55.9%（80/143）和 69.4%（75/108）。在 58 份涂片显微镜阳性（sm +）样本中，TLA 分离 MTB 的性能与 LJ（82.8% vs. 87.9%；P = 0.43）和 MGIT（82.8% vs. 93.6%；P = 0.093）相当。85 份涂片阴性（sm -）样本中，TLA 与 LJ（34.1% vs 34.1；P = 1.000）表现相同，但低于 MGIT（34.1% vs 50.7%；P = 0.055）。TLA 的不可判读结果发生率（4.9%）低于 LJ（7.0%）和 MGIT（5.1%），但差异无统计学意义。TLA 不可判读结果主要由污染（4 例）或培养基干燥（3 例，因培养时蜡烛距离过近）导致，而 LJ 和 MGIT 的主要问题是污染。

sm + 样本中，TLA 检测到 MTB 初次生长的中位时间为 15 天（四分位数间距 IQR 12 - 21），与 MGIT 的 14 天（IQR 10 - 23.5）相近，且显著快于 LJ 的 26 天（IQR 21 - 32）。sm - 样本中，TLA 检测到 MTB 生长的中位时间为 22 天（IQR 20 - 27），MGIT 为 25.5 天（IQR 19.5 - 32.75），LJ 为 44 天（IQR 30 - 55.5）。由于 TLA 在 MTB 分离的同时可提供 pDST 结果，在这方面优于其他两种基于培养的 pDST 方法。

在 TLA 方法评估的条件中，对于含 STC 的 TLA 板，培养方式对 MTB 分离率无显著影响（sm + 样本 P = 1，sm - 样本 P = 0.28）。但不含 STC 的 TLA 板在 sm - 样本中的 MTB 分离率（71.4%）显著高于含 STC 的板（27%，P = 0.0037）。在 sm + 样本中，不含 STC 的板分离率为 90.9%，含 STC 的板为 80.9%，差异不显著（P = 0.67）。以 LJ 培养为基线比较三种实验条件，发现不同条件下的差异不太可能是随机变异导致（sm + 样本 P = 0.027，sm - 样本 P < 0.001）。

在直接 TLA - DST 生长阳性的 77 个样本中，67 个有参考 pDST 结果可对比，其中 29 个来自 LJ，38 个来自 MGIT。与间接 DST 相比，TLA 检测 RIF 耐药性的特异性为 93.6%，INH 为 85.7%，LFX 和 BDQ 均为 100%；敏感性方面，RIF 为 95%，INH 为 84.6%。由于队列中 BDQ 耐药菌株缺失、LFX 耐药菌株数量不足，无法评估这两种药物的敏感性。对比直接 TLA 与间接 MGIT 或 LJ DST 的差异结果，16 个不一致结果中有 13 个（81%）得到解决，其中 9 个（69%）支持 TLA 检测结果。经调整后，直接 TLA - DST 检测 RIF 耐药性的敏感性为 100%，INH 为 87.8%；特异性方面，除 INH 为 96.2% 外，其他药物均为 100%。

讨论

本研究表明，TLA 在间接 BDQ - MIC 测定以及直接 MTB 分离和 BDQ 等抗结核药物 DST 方面，与基于 LJ 和 MGIT 的传统 pDST 方法相比表现良好。

间接 TLA 检测 H37Rv 菌株的 BDQ - MIC 值，证实了其技术准确性，MIC 值始终低于暂定临界浓度 0.25 μg/mL，且 99% 在 BDQ 参考 MIC 质量控制范围内（0.015 - 0.12 μg/mL）。与传统管法 MIC 测定相比，TLA - MIC 测定节省时间和耗材，D7 读数结果最佳。标准培养箱的效果优于 5% - 10% CO?培养箱，更有利于 TLA 在常规诊断中的应用。虽然此前有研究认为 CO?培养可缩短检测时间，但本研究发现两种方法在检测时间上无显著差异，且在两种条件下第 7 天均可获得可靠结果。

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