TBseq检测技术在结核病诊断中的突破性进展

《Journal of Clinical Microbiology》：Nanopore sequencing for precise detection of Mycobacterium tuberculosis and drug resistance: a retrospective multicenter study in China

　　结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, M.tb）引起的古老传染病，至今仍是全球健康的重大威胁。据世界卫生组织（WHO）2024年全球结核病报告，2023年结核病可能再次成为全球单一传染因子导致死亡的首要原因，当年新诊断结核病病例达1080万，估计因结核病死亡人数达125万。耐药结核病（DR-TB）的存在进一步加剧了治疗的复杂性，并对公共卫生构成了巨大挑战。WHO将DR-TB分为多个类别，包括多药耐药结核病（MDR-TB）、广泛耐药结核病（XDR-TB）和准广泛耐药结核病（pre-XDR-TB）。传统的耐药结核病治疗方案复杂，疗程长，副作用多，经济负担重，但近年来推出的BPaL(M)方案（包含贝达喹啉、普雷托马尼德和利奈唑胺，可加用或不加莫西沙星）简化了治疗流程，缩短了治疗时间。然而，2021年全球新发利福平（RIF）耐药结核病病例估计达45万，较2020年增长3%，这是自2015年以来的首次增长。其中仅有16.1万患者接受了治疗，近三分之二的患者未能及时诊断和治疗，凸显了快速预测药物耐药性以优化抗生素治疗、改善患者预后的迫切需求。

目前，耐药结核病的诊断主要依赖于体外药物敏感性测试（DST），包括表型和分子方法。表型药物敏感性测试（pDST）虽然是金标准，但耗时且易受环境因素影响。而分子检测方法如Xpert MTB/RIF虽然能快速出结果，但只能检测常见突变，缺乏全面的耐药性谱。第二代测序技术虽速度快、通量高，但在结核病诊断中的应用受到序列偏差、高资源需求和操作复杂性等因素的限制。

第三代测序技术，如太平洋生物科学公司的单分子实时测序和牛津纳米孔技术公司的纳米孔测序，因其长读长（数十至数百kb）、高通量、快速和易于使用等特点，逐渐成为临床应用的有力候选。纳米孔测序技术尤其在结核病诊断和耐药性分析方面显示出巨大潜力。初步研究表明，该技术与传统方法的一致性接近完美，检测周期短（数小时至数天），且灵敏度和特异性优于现有检测方法，有望彻底改变结核病和耐药结核病的诊断。

尽管如此，纳米孔测序技术在结核病筛查和耐药结核病诊断中的临床应用尚未广泛开展，大规模临床研究验证其在耐药结核病诊断中的适用性和可靠性仍显不足。本研究旨在填补这一空白，通过大规模横断面研究评估TBseq检测技术的诊断性能，该技术是一种基于纳米孔测序的目标测序检测方法，可同时鉴定分枝杆菌种类并预测结核分枝杆菌复合群（MTBC）菌株的药物耐药性。

本研究为多中心回顾性研究，于2022年9月至2023年7月在中国六家专科医院共纳入1161名疑似活动性结核病患者，最终829名患者纳入分析。研究结果表明，TBseq检测技术在结核病诊断中的表现显著优于其他方法，灵敏度达90.9%（95%置信区间：88.9%–93.0%），特异性为93.0%（95%置信区间：97.2%–99.5%），曲线下面积（AUC）为0.92（95%置信区间：0.876–0.963）。此外，TBseq检测技术对七种抗结核药物（利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、左氧氟沙星、阿米卡星和卡那霉素）的耐药性预测能力强大，所有药物的灵敏度和特异性均超过90%，AUC值范围为0.919至0.998，显示出高诊断准确性。

本研究的样本类型多样，包括痰液、支气管肺泡灌洗液（BALF）、组织、脓液、脑脊液（CSF）、尿液、胸腔积液和腹水等。研究发现，TBseq检测技术在不同样本类型中均表现出色，尤其是在痰液样本中，灵敏度最高，使其成为资源有限环境中的首选检测方法。此外，对于那些无法提供痰液样本或痰液样本不足的患者，支气管肺泡灌洗液（BALF）是优先选择。

在药物耐药性方面，研究对720例结核病患者进行了七种一线和常见二线抗结核药物的耐药性测试，结果显示，TBseq检测技术与表型药物敏感性测试（pDST）结果的一致性接近90%，在所有检测药物中，TBseq检测技术的灵敏度和特异性均超过90%，显示出其作为耐药性预测工具的巨大潜力。然而，研究也发现了一些不一致的结果，其中TBseq检测技术阴性但pDST阳性的情况可能与样本中细菌载量低于检测阈值有关，而TBseq检测技术阳性但pDST阴性的情况可能表明存在低水平耐药性，这需要更复杂的检测方法来确认。

本研究的局限性包括“非疾病”参与者的数量相对较少，这限制了对特异性估计的精确性，并降低了检测测试之间特异性差异的能力。此外，样本收集自中国六个不同省份或地区的指定结核病医院，可能无法完全反映全国结核病患者特征的多样性。未来的研究应扩大地理覆盖范围，以确保样本更具代表性和广泛性。

综上所述，本研究通过大规模临床样本验证了TBseq检测技术在结核病诊断中的高效性和准确性，为快速诊断和药物敏感性预测提供了有力工具。TBseq检测技术的快速检测能力和高准确性使其有望成为临床实践中结核病识别和药物耐药性分析的首选方法，从而显著提高结核病诊断的准确性和及时性，加强结核病的管理。