《Infection and Immunity》：Sphingosine-mediated death of Pseudomonas aeruginosa involves degradation of cardiolipin by the maintenance of outer lipid asymmetry system
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本研究揭示了鞘氨醇（Sphingosine）通过靶向铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的Mla系统，诱导其膜脂质心磷脂（Cardiolipin）降解，从而快速杀灭细菌的机制，为耐药菌感染治疗提供了新思路。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在的机会性病原体，尤其在囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）患者、慢性阻塞性肺疾病患者以及免疫受损或老年患者中，常引发严重的呼吸道感染。这些感染不仅难以治疗，还容易发展为慢性感染，导致患者反复住院，增加病死率。近年来，随着抗生素的广泛使用，耐药铜绿假单胞菌菌株不断增加，使得传统治疗手段的效果大打折扣，开发新型抗菌策略迫在眉睫。
本研究聚焦于一种名为鞘氨醇（Sphingosine）的小分子化合物，它在健康人体和野生型小鼠的呼吸道上皮细胞表面大量存在，但在囊性纤维化患者和CF小鼠的呼吸道上皮细胞表面几乎无法检测到。研究团队此前已发现，鞘氨醇在体外（in vitro）和体内（in vivo）均能有效杀灭多种细菌，包括铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）等。然而，鞘氨醇如何针对铜绿假单胞菌发挥抗菌作用的具体机制尚不清楚。
研究团队通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察到，铜绿假单胞菌在与鞘氨醇接触后，其细菌膜迅速发生显著变化。仅在接触10分钟后，细菌膜便开始出现卷曲现象，并形成新的内膜结构。这种膜卷曲现象很可能是导致细菌通透性增加的原因，而内膜结构的增加可能是细菌试图修复受损膜的一种尝试。到了30分钟时，细菌已经死亡。此外，通过TEM断层扫描技术（TEM tomography）分析，研究团队进一步确认了鞘氨醇处理后细菌膜卷曲并最终从细菌上脱落的过程，以及新内膜结构的形成，这表明鞘氨醇并非简单地引起细胞溶解。
为了探究鞘氨醇是否靶向细菌的外膜，研究团队采用了一种低剂量的鞘氨醇（0.1 μM）预处理细菌，随后再用低剂量的十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate, SDS）处理细菌。结果显示，经过鞘氨醇预处理的细菌，其外膜对SDS的通透性增加，使得SDS能够杀灭细菌，而单独使用SDS则无法达到这一效果。这表明鞘氨醇能够改变铜绿假单胞菌外膜的通透性。
研究团队进一步假设，鞘氨醇可能通过其带正电荷的氨基（NH?）基团与细菌膜中的心磷脂（Cardiolipin）结合，并将其从内膜转移到外膜，使其靠近细菌的Mla系统，尤其是磷脂酶MlaY。为了验证这一假设，研究团队检测了鞘氨醇对铜绿假单胞菌心磷脂含量的影响。结果表明，即使是低剂量的鞘氨醇（1 μM），也能在短时间内引起细菌心磷脂的显著减少。通过放射性同位素标记和薄层色谱（Thin-Layer Chromatography, TLC）分析，研究团队进一步确认了鞘氨醇能够快速降解心磷脂。
接下来，研究团队测试了抑制铜绿假单胞菌磷脂酶A?（Phospholipase A?, PLA?）活性是否能够阻止鞘氨醇诱导的心磷脂降解。实验中使用了多种PLA?抑制剂，如AACOCF?、VU0364739、OBAA、FIPI、darapladip和aristolochic acid。结果显示，这些抑制剂均能减少或完全阻止鞘氨醇对心磷脂的降解作用。此外，PLA?抑制剂还能防止鞘氨醇诱导的细菌死亡，而作为阴性对照的PLC抑制剂U73122则没有这种效果。这表明PLA?活性在鞘氨醇诱导的细菌死亡中起着关键作用。
为了从遗传学角度证实特定磷脂酶在鞘氨醇介导的铜绿假单胞菌杀伤中的重要性，研究团队使用了Mla途径的突变菌株。MlaA和MlaZ是脂质转运蛋白，负责磷脂在脂质双层之间的运输，而MlaY则是一种脂酶，负责脂质的降解。研究发现，与野生型菌株相比，这些突变菌株在鞘氨醇处理后心磷脂的降解显著减少，且对鞘氨醇诱导的死亡表现出更高的抵抗力，尤其是缺乏脂酶MlaY的菌株。
研究团队还探讨了鞘氨醇对哺乳动物细胞的影响。由于哺乳动物细胞的质膜中不含心磷脂，而仅线粒体膜中含有心磷脂，这可能是哺乳动物细胞对鞘氨醇相对耐受的原因之一。此前的研究表明，即使在高剂量（高达500 μM）的鞘氨醇吸入下，小鼠或猪的呼吸道上皮细胞也未表现出毒性。这表明鞘氨醇可能是一种具有选择性抗菌活性的化合物，能够在不引起宿主细胞炎症反应的情况下快速杀灭呼吸道中的病原体。
此外，研究还发现铜绿假单胞菌能够感知鞘氨醇的存在，主要通过转录因子SphR，进而表达一个功能未知的基因SphA。SphR的缺失会增加铜绿假单胞菌对鞘氨醇的敏感性。此外，鞘氨醇可能通过SphR诱导表达磷脂酶C/鞘磷脂酶（PlcH），这对于铜绿假单胞菌的致病性至关重要。这种反应可能是细菌对宿主释放的鞘氨醇的一种反击机制，尤其是在低浓度鞘氨醇的情况下。
综上所述，本研究揭示了鞘氨醇通过靶向铜绿假单胞菌的Mla系统，特别是磷脂酶MlaY，诱导心磷脂降解，从而导致细菌死亡的分子机制。这一发现不仅为开发新型抗菌治疗策略提供了理论依据，也为理解宿主-病原体相互作用中的脂质代谢调控提供了新的视角。未来的研究将进一步探索鞘氨醇在不同临床环境中的应用潜力，以及其与其他抗菌药物联合使用的可能性，以期为耐药菌感染的治疗提供更有效的解决方案。
