海洋微生物新突破：Pseudovibrio属遗传工具的开发与应用

《Applied and Environmental Microbiology》：Evaluation of vectors for gene expression in Pseudovibrio marine bacteria

Pseudovibrio属细菌具有重要生态和生物技术潜力，本文开发了其遗传工具，助力相关研究。

　　### 一、引言
Pseudovibrio属细菌作为 α- 变形菌门的一员，广泛存在于海洋环境中，常与海洋海绵、珊瑚、藻类等生物共生。研究发现，它仅从健康海绵中分离得到，还能产生抑制海绵病原体生长的抗生素，且有垂直传播的证据，这表明其可能对海洋海绵健康有重要贡献。此外，它还能诱导珊瑚幼虫的定居行为，在海洋生态系统中扮演着关键角色。

遗传学工具对于深入研究Pseudovibrio属细菌的生物学特性以及挖掘其生物技术应用潜力至关重要。此前研究人员从Pseudovibrio brasiliensis Ab134 中发现了特殊代谢物假弧菌酰胺（pseudovibriamides），编码该物质的ppp基因簇存在于约三分之二的Pseudovibrio基因组中。通过反向遗传学方法（基因敲除），揭示了假弧菌酰胺与细菌群体行为（如鞭毛介导的运动和生物膜形成）之间的联系，而这些行为对细菌在宿主中的定植和生存意义重大。然而，尽管已有基因敲除等方法，但一直没有可用于Pseudovibrio属细菌基因表达的自我复制载体，这限制了对其更深入的研究。

二、实验结果

1. 建立适用于P. brasiliensis Ab134 的宽宿主范围载体
   研究人员获取并测试了含有两种不同宽宿主范围复制子（RSF1010 和 pBBR1）的质粒载体。通过结合实验将相应质粒（pAM4891、pSEVA234M 和 pSEVA237R_Pem7）从Escherichia coli转移到P. brasiliensis Ab134 中，并经质粒提取、限制性酶切和凝胶电泳验证获得的克隆。利用短读长 Illumina 测序估计质粒拷贝数，结果显示 RSF1010 在P. brasiliensis Ab134 中为中等拷贝数（49），pBBR1 为高拷贝数（148 - 210）。

在液体培养的生长比较实验中，携带 pAM4891（RSF1010 复制子）的P. brasiliensis Ab134 与野生型相比，总生长曲线下面积相当，但延迟期延长约 40%。而携带 pSEVA234M 和 pSEVA237R_Pem7（均含 pBBR1 复制子）的菌株呈现不同生长表型，pSEVA234M 出现生长缺陷，尽管延迟期未受影响，但最终的光密度（OD₆₀₀）和生长曲线下面积显著降低。经分析，这可能是由于 pSEVA234M 质粒拷贝数较高（210），且其携带的lacI^q-Ptrc 阻遏 - 启动子元件导致lacI阻遏蛋白高表达，进而影响生长；而携带 pSEVA237R_Pem7 的菌株则未出现该缺陷。综合考虑，研究人员选择 pAM4891 和 pSEVA237R_Pem7 进行后续实验。
2. pSEVA237R_Pem7 在结合实验中优于 pAM4891，但在电穿孔实验中无优势
采用电穿孔和从E. coli S17 - 1 结合的方法，评估 pAM4891 和 pSEVA237R_Pem7 导入P. brasiliensis Ab134 的 DNA 转移效率。由于这两种质粒分别组成型表达绿色荧光蛋白基因（gfp）和红色荧光蛋白基因（mCherry），可通过荧光快速筛选阳性克隆。结果显示，pAM4891 和 pSEVA237R_Pem7 的电穿孔效率相当（分别为 3295 ± 271 CFU/μg 质粒 DNA 和 2776 ± 495 CFU/μg 质粒 DNA），无统计学显著差异。但在结合实验中，pSEVA237R_Pem7 的结合频率（2.22×10^?3 ± 6.69×10^?4）显著高于 pAM4891（3.86×10^?6 ± 3.34×10^?7）。
3. pAM4891 和 pSEVA237R_Pem7 在传代研究中均有一定稳定性，pSEVA237R_Pem7 更优
评估质粒稳定性对研究至关重要，在无抗生素选择压力下评估质粒稳定性可减少抗生素对细菌表型（如群体运动和代谢）的潜在影响。研究人员对 pAM4891 和 pSEVA237R_Pem7 进行了连续五代（共 120 小时）的传代实验。由于 pAM4891 和 pSEVA237R_Pem7 分别组成型表达gfp和mCherry，因此可通过菌落荧光判断质粒是否丢失。结果发现，在前三代（72 小时），超过 97% 的 Ab134 细胞保留了 pAM4891，但到第四代时保留率降至 85.4%，第五代降至 76.6%。而携带 pSEVA237R_Pem7 的 Ab134 细胞在五代传代过程中（120 小时），质粒保留率始终为 100%，表明 pSEVA237R_Pem7 具有更高的长期质粒稳定性。
4. pSEVA237R_Pem7 导致群体运动起始延迟
自我复制载体常用于基因表达研究，如遗传互补实验或用荧光蛋白标记菌株。研究人员此前发现假弧菌酰胺缺陷突变株（ΔpppA）的群体运动能力较野生型降低。在此基础上，研究携带自我复制载体是否会影响野生型和 ΔpppA菌株的群体运动，以及在群体运动实验中不进行选择时能否检测到荧光蛋白表达。结果显示，携带 pAM4891 载体的菌株群体运动能力与亲本菌株相当，而携带 pSEVA237R_Pem7 载体的菌株群体运动表型出现延迟。不过，携带这两种载体的 ΔpppA菌株群体运动能力仍低于携带相同载体的野生型菌株。此外，在实验 3 天后，即使不进行抗生素选择，也能检测到荧光蛋白表达，这与之前的稳定性研究结果一致，表明两种载体在 3 天的实验过程中均能稳定维持。

三、讨论

Pseudovibrio属自 2004 年被首次描述以来，在全球海洋环境中广泛被分离或检测到，主要来源于海洋海绵、珊瑚等生物，还包括被囊动物、扁虫、藻类等。它在海洋生态系统中不仅可能参与生物地球化学循环、提供营养，还对海洋海绵健康和珊瑚幼虫定居有促进作用。因此，开发Pseudovibrio属细菌的遗传工具对于探索其生态和生物技术潜力至关重要。

研究人员首次证明了含有 RSF1010 和 pBBR1 两种宽宿主范围复制子的载体可用于P. brasiliensis中表达绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（mCherry）。RSF1010 复制子属于 IncQ 质粒群，其野生型在E. coli中的拷贝数较低（10 - 12），但本研究中使用的 pAM4891 载体因 RSF1010 mobA基因的 Y25F 突变，使得质粒制备中多为超螺旋 DNA，从而在P. brasiliensis Ab134 中呈现较高拷贝数（49）。pBBR1 复制子不属于 IncP、IncQ 和 IncW 群，可能代表一个新的不相容群，其在革兰氏阴性菌中宿主范围广泛，在E. coli和Bordetella pertussis中报道的拷贝数为 30 - 40，但在一些细菌中会因高拷贝数导致生长缺陷。本研究中含有 pBBR1 复制子的两种载体在P. brasiliensis中均为高拷贝数（148 - 210），但仅 pSEVA234M 出现生长缺陷，推测是高拷贝数和lacI^q阻遏蛋白高表达共同作用的结果。

在质粒转移效率方面，pSEVA237R_Pem7（3855 bp）通过结合实验导入P. brasiliensis Ab134 的效率显著高于 pAM4891（7868 bp），这与质粒越小结合率越高的研究结果相符。而在电穿孔实验中，虽然理论上质粒大小与电穿孔效率呈负相关，但在本研究使用的低场强（9 kV/cm）条件下，所测试范围内质粒大小的影响可忽略不计，因此两种质粒的电穿孔效率无显著差异。此外，结合实验比电穿孔更有效地将质粒导入P. brasiliensis Ab134，这可能是因为结合实验转移的是单链 DNA，可绕过受体菌株的 DNA 限制 - 修饰系统，而电穿孔等方法摄取的是双链 DNA。研究人员还在P. brasiliensis Ab134 中鉴定出一种 II 型限制 - 修饰系统，未来有望利用该系统进一步提高 DNA 转移效率。

虽然携带 pSEVA237R_Pem7 和 pAM4891 的P. brasiliensis菌株与野生型生长相当，但它们的群体运动能力受到不同程度的影响。pSEVA237R_Pem7 拷贝数较高，其表达的 mCherry 可能给细胞代谢带来负担，影响群体运动相关蛋白的合成，从而导致群体运动能力下降。综合各项实验结果，研究人员建议在遗传互补实验中使用 pAM4891，因为它对群体运动的影响较小，且在 3 天内稳定性良好，足以满足群体运动实验和假弧菌酰胺生产研究的需求。

四、材料和方法

1. 一般实验程序
   实验中所用的化学试剂和酶购自 Sigma - Aldrich、VWR、Becton Dickinson（BD）和 Thermo Fisher Scientific 等公司，限制性内切酶购自 New England Biolabs（NEB）。采用 GenElute^TM Bacterial Genomic DNA Kit（Sigma - Aldrich）提取基因组 DNA，使用 ZymoPURE Plasmid Miniprep kits 提取质粒 DNA，并通过 Primordium labs 进行全质粒测序，以确保质粒载体序列与 Addgene 和 SEVA 库中的一致。
2. 细菌培养
   P. brasiliensis Ab134 野生型和 ΔpppA突变株在 BD Difco Marine Agar 2216（MA）或 BD Difco Marine Broth 2216（MB）中，30°C 培养 18 - 24 小时，根据需要使用卡那霉素（200 μg/mL）进行突变株筛选。E. coli菌株在 BD Difco Luria Broth（LB）或 LB 琼脂上，30°C 培养 18 - 20 小时，使用卡那霉素（50 μg/mL）进行突变株筛选。E. coli DH5α 用于质粒载体的扩增，E. coli S17 - 1 用于与 Ab134 进行结合实验。所有菌株均在 20% 甘油（v/v）中，-80°C 冷冻保存。
3. 质粒通过结合实验导入P. brasiliensis Ab134
   采用与之前类似的方法，将质粒载体从E. coli S17 - 1 通过结合实验转移到 Ab134 中。先将载体电穿孔导入E. coli S17 - 1，然后分别培养 Ab134 和E. coli S17 - 1 至光密度（OD₆₀₀）达到 0.4 - 0.6，收集细胞并调整浓度后混合，将混合液涂在 MA 平板上，19 小时后在含有卡那霉素（200 μg/mL）和羧苄青霉素（50 μg/mL）的 MA 平板上筛选结合子，阳性克隆经过夜培养后用于质粒提取，并通过限制性酶切和凝胶电泳进行验证。
4. 通过滤膜结合实验评估结合效率
   滤膜结合实验的方法是在之前研究的基础上进行调整。制备好浓度合适的细胞悬液后，将E. coli S17 - 1 和 Ab134 的细胞悬液混合，接种在 0.45 - μm 孔径的细胞酯膜滤器上，培养 19 小时后收集生物量并进行系列稀释，在含有卡那霉素（200 μg/mL）和羧苄青霉素（100 μg/mL）的 MA 平板上筛选结合子，同时设置仅 Ab134 或E. coli S17 - 1 含相应质粒的阴性对照。通过计数菌落形成单位（CFU），按照特定公式计算结合效率的对数值（log₁₀）。
5. 质粒通过电穿孔导入P. brasiliensis Ab134
   制备 Ab134 电转化感受态细胞时，将过夜培养的种子液接种到 MB 中，培养至 OD₆₀₀为 0.4 - 0.6，离心收集细胞，用冰预冷的 250 - mM 蔗糖溶液洗涤 3 次，重悬后分装用于电穿孔。将适量的 pAM4891 或 pSEVA237R_Pem7 加入感受态细胞中，在 1.8 kV 的条件下进行电穿孔，电穿孔后的细胞与冰预冷的 MB 混合，30°C 振荡培养 1.5 小时后，离心收集细胞并涂布在含有卡那霉素（200 μg/mL）的 MA 平板上筛选阳性克隆，同时设置未加质粒的感受态细胞作为对照。通过观察荧光确认转化是否成功，并计算电穿孔效率（CFU/μg 质粒 DNA）。
6. 相对质粒拷贝数的测定
   使用 GenElute Bacterial Genomic DNA Kit 提取携带不同质粒（pAM4891、pSEVA234M 和 pSEVA237R_Pem7）的P. brasiliensis Ab134 的总 DNA，经质量评估后，进行 Illumina 双端全基因组测序。将测序得到的序列与 Ab134 基因组参考序列（GenBank: GCA_018282095.1）和导入的质粒序列进行比对，根据比对结果中各位置的覆盖度统计信息，按照特定公式计算质粒拷贝数。
7. 生长曲线的测定
   采用微孔板法跟踪各细菌菌株 46 小时的生长情况。先制备种子液，将其稀释至 OD₆₀₀为 0.05 后，分装到 96 孔板中，每孔 200 μL，设置 10 个重复，同时设置仅含 MB 的空白对照。将平板在 30°C、887 转 / 分钟（振幅 1 mm）的条件下振荡培养，每 30 分钟测定一次 OD₆₀₀值。利用 R 集成开发环境，采用梯形法计算生长曲线下面积，并按照特定方法计算延迟期。
8. 质粒稳定性比较
   在无选择压力下，对P. brasiliensis Ab134 中质粒的稳定性进行五代（120 小时，约 50 代）的评估。将携带 pAM4891 或 pSEVA237R_Pem7 的 Ab134 菌株在含有卡那霉素（200 μg/mL）的 MB 中过夜培养，然后去除卡那霉素，对细胞进行系列稀释并涂布在 MA 平板上，在不同时间点（0、24、48、72、96、120 小时）计数荧光菌落，按照特定公式计算质粒稳定性百分比。
9. 群体运动实验
   群体运动实验方法与之前报道一致。制备含有 0.5%（wt/vol）Eiken 琼脂的群体运动琼脂，冷却至 55°C 后分装到培养皿中，空气干燥 20 分钟。将细菌菌株的新鲜培养物调整至 OD₆₀₀为 1.0，取 5 μL 滴在平板中心，空气干燥后 30°C 培养，每天用手机相机拍摄可见光照片，同时使用 ChemiDoc MP Imaging System 进行荧光成像，观察 3 天。
10. 荧光成像
    使用 ChemiDoc MP Imaging System 进行荧光成像，分别使用 Cy2（532 nm/28 mm）和 Alexa 546（602 nm/50 mm）通道检测绿色和红色荧光。

五、研究意义与展望

本研究成功开发了适用于P<