高浓度 CO2对蓝藻的影响：氧化应激、抗氧化反应及调控机制

本文揭示了 1% CO2对蓝藻（Synechococcus elongatus PCC 7942）的生理调控及机制。

　　

引言

蓝藻起源于约三十亿年前的地球，在地球大气从无氧到有氧的转变过程中发挥了关键作用，这一过程被称为大氧化事件。随着地球大气中氧气含量逐渐增加，二氧化碳（CO₂）浓度从高（>1%）逐渐降低到低（~0.04%）水平，蓝藻也逐渐适应了低 CO₂环境，进化出了诸如 CO₂浓缩机制等有效策略，以提高在低 CO₂条件下的光合自养性能。

然而，由于人为和地质活动导致的 CO₂排放迅速增加，蓝藻在多种场景下会暴露于高浓度的 CO₂中。例如，在生物技术应用中，蓝藻常被用作将 CO₂转化为高价值化学品和可持续生物燃料的理想底盘，这一过程通常需要在较高浓度的 CO₂环境中培养光合蓝藻；在自然环境中，地质 CO₂封存点的 CO₂泄漏以及航运业的 CO₂排放，都会使蓝藻面临高浓度 CO₂的影响。因此，深入了解蓝藻对高浓度 CO₂的生理反应，从生物技术和生态学角度来看都具有重要意义。

此前已有研究表明，高浓度 CO₂会影响蓝藻对氮、磷的同化以及光的利用。在高 CO₂条件下，蓝藻对氮、磷的利用增强，这是因为高浓度 CO₂会导致蓝藻代谢途径失衡，从而刺激氮、磷用于蛋白质、磷脂和三磷酸腺苷（ATP）的合成。当氮、磷浓度有限时，蓝藻会调节细胞内活动，降解额外的细胞成分，如藻胆体，以补偿氮、磷的不足。同时，光的利用也会相应增强，促进光磷酸化，产生更多的 ATP 和氧化还原当量，以促进氮、磷的代谢。此外，高浓度 CO₂还会增强蓝藻的某些特定功能，如固氮和毒素产生。

一般来说，外部应激条件，如高盐度、光照波动或营养缺乏，会导致蓝藻细胞内产生活性氧（ROS）。这是由于应激诱导的光驱动电子传递与 CO₂固定的电子消耗之间的不平衡所致。ROS 会被蓝藻感知，从而迅速启动抗氧化反应，包括合成超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等抗氧化酶来清除 ROS。抗氧化反应对于蓝藻在外部应激条件下的生存和生长至关重要。然而，高浓度 CO₂是否能被视为一种氧化应激，从而激活蓝藻的抗氧化反应，目前尚不清楚。为了解决这一问题，本研究以模式蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942 为研究对象，通过多种生理、生化和遗传方法，探究其在高浓度 CO₂（1% CO₂）环境下的生理调节和潜在策略。

材料与方法

1. 蓝藻菌株和生长条件：S. elongatus PCC 7942（野生型 [WT]）及其突变体在 BG - 11 培养基（100 mL 体积）中培养，在 30°C、120 rpm 的旋转条件下，以 50 μmol 光子 /m²/s 的恒定光照进行培养。为了研究S. elongatus PCC 7942 在暴露于 1% CO₂时的生理反应，先将菌株在大气（0.04%）CO₂条件下培养，直至光密度在 730 nm（OD₇₃₀）达到 0.8，然后将细胞转移到含有 1%（体积 / 体积）CO₂的大气中。通过用等量的氯化镁（MgCl₂）替代硫酸镁（MgSO₄）获得不含硫酸盐的 BG - 11 培养基；通过添加相应浓度的 MgSO₄，制备含有 1、20、40、100、200 或 300 μM 硫酸盐的 BG - 11 培养基。每 2 天从螺旋盖培养瓶中取出 2 mL 培养物，通过分光光度计（METASH UV - 6100，中国）测量 OD₇₃₀来监测细胞生长。
2. S. elongatus PCC 7942 突变株的构建：通过质粒构建和自然转化，构建了S. elongatus PCC 7942 的 ΔgpxA和 ΔcysR菌株，这两种菌株分别在gpxA和cysR基因上存在无效突变。以质粒 pUC19 为骨架，构建含有目标基因gpxA和cysR两侧 1000 bp DNA 序列以及编码壮观霉素抗性基因的基因敲除载体。将重组质粒在Escherichia coli DH5α 中扩增并分离。将 100 ng 重组质粒加入到S. elongatus PCC7942 中，在 30°C 避光培养 17 h。转化后，将菌株在添加有 2 μg/mL 壮观霉素和链霉素的 BG - 11 平板上培养。用于固体平板培养的 BG - 11 平板还含有 1%（重量 / 体积）琼脂糖（Biosharp，中国）、20 mM 碳酸氢钠（NaHCO₃）和 1.6 mM 硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃），并在 30°C、50 μmol 光子 /m²/s 的光照下培养。通过菌落聚合酶链反应（PCR）和测序确认gpxA和cysR基因的缺失。PCR 反应条件包括：95°C 初始变性 5 min，然后进行 35 个循环，每个循环包括 94°C 变性 25 s、55°C 退火 40 s 和 72°C 延伸 45 s，最后 72°C 保温 10 min。引物序列见表 S5。
3. 实时定量 PCR 分析：采用实时定量 PCR（RT - qPCR）分析来定量关键差异表达基因（DEGs）的丰度，以验证转录组分析的结果。采集S. elongatus PCC7942 野生型菌株及其突变体 ΔgpxA和 ΔcysR的细胞。使用 M5 EASYspin Plus Bacterial RNA Rapid Extraction Kit（Mei5bio，北京，中国）从蓝藻的对数生长期培养物中分离总 RNA。定量后，使用带有 gDNA 去除剂的 M5 Super plus qPCR RT kit（Mei5bio，北京，中国）将提取的 RNA 逆转录为 cDNA，并储存在 - 20°C。逆转录后，制备 20 μL PCR 反应体系，包括 2.0 μL cDNA 模板、0.8 μL 引物溶液和 17.2 μL SYBR Premix EsTaq（含 Tli RNaseH）（Mei5bio，北京，中国）。所有操作均在冰浴和黑暗条件下进行。以 16S rDNA 为内参，每个样品进行三次重复评估以确保一致性。使用 7900HT Fast Real - Time PCR System（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）对样品进行分析。RT - qPCR 的荧光定量 PCR 条件包括：95°C 初始变性 30 s，然后进行 40 个循环，每个循环包括 94°C 变性 15 s、55°C 退火 30 s 和 72°C 延伸 60 s。通过 2^?ΔΔCt方法对目标基因进行定量，公式如下：^?ΔΔCt = [(Ct_{target gene} - Ct_{internal control})_control - (Ct_{target gene} - Ct_{internal control})_sample]其中 Ct 是循环阈值。
4. S. elongatus PCC 7942 氧化应激和抗氧化反应的分析：使用相应的检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京，中国），按照制造商的说明测量 ROS 浓度和总还原硫醇池水平。将 2 mL 蓝藻培养物在 8000 × g下离心 5 min，弃去上清液，将细胞重悬于 10 mM 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2 和 7.4）中，浓度调整为 1 × 10⁸细胞 /mL。通过 DCFH - DA 荧光探针检测细胞内 ROS，使用荧光微孔板读数仪（Varioskan Lux；Thermo Fisher Scientific）进行荧光检测。对于总还原硫醇池检测，制备 5 mL 细胞悬浮液进行超声处理（超声功率 100 W，工作 5 s，间隔 5 s，总破碎 10 min）。还原硫醇池与 5,5′ - 二硫代双 - 2 - 硝基苯甲酸反应生成黄色化合物，随后在 405 nm 处通过比色法进行定量。
5. 藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量的测量：在规定的时间间隔（转移到 1% CO₂大气后 2 天）取出 2 mL 蓝藻培养物，在 8000 × g下离心 5 min，弃去上清液，将沉淀重悬于 10 mL PBS（pH 7.2 和 7.4）中。对细胞悬浮液进行上述超声处理，然后在 4°C、10000 × g下离心 5 min。使用紫外 - 可见分光光度计在 620 nm 和 650 nm 处分别测定上清液中藻蓝蛋白（PC）和别藻蓝蛋白（APC）的含量，通过测定吸光度来定量 PC 和 APC 的含量。
6. 转录组测序和生物信息学分析：为了研究S. elongatus PCC 7942 在暴露于 1% CO₂时的反应，将培养至 OD₇₃₀为 0.8 的菌株转移到含有 1% CO₂的大气中，分别处理 40 min 或 4 h，然后将细胞在 10000 × g下离心 10 min。对于研究硫酸盐限制对野生型和 ΔcysR菌株的影响，将培养物培养至 OD₇₃₀为 0.8，转移到含有 1% CO₂的大气中 4 h，然后离心。实验使用生物学重复样本。使用 TRIzol 试剂从S. elongatus中提取总 RNA，使用 DNase I（Takara，日本）去除基因组 DNA。将每个样品的 5 μg 总 RNA 作为起始材料，使用 TruSeq RNA sample preparation kit（Illumina，美国圣地亚哥，CA）生成测序文库。使用 Illumina NovaSeq 6000 测序仪（上海宝生物工程有限公司）对获得的配对末端文库进行测序。

基因读数来自 Rockhopper。通过局部回归分析获得基因表达数据，然后使用负二项模型对每个基因比较进行零假设检验，得到相应的P值。使用 Benjamini - Hochberg（BH，一种控制错误发现率 [FDR] 的方法）对P值进行多重校正，以计算显著基因比较的 FDR。差异表达基因（DEGs）的选择标准基于 log₂(fold change)、FDR 和其他参数。log₂(fold change) 值≥1 且 FDR≤0.05 作为筛选 DEGs 的阈值。使用 KOBAS 通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径分析来阐明 DEGs 的功能，并使用 Fisher 精确检验进行统计计算。使用 BH（FDR）方法进行多重检验以控制假阳性的识别。计算阈值设定为P值 0.05，满足该条件的 KEGG 途径被定义为 DEGs 显著富集的途径。所有分析和引物设计使用的基因组注释来自 KEGG，可在https://www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=syf获取。7. 统计分析：使用 Origin 进行统计分析。使用 Student’s t检验确定组间比较的统计学意义。当P < 0.05 时，差异被认为具有统计学意义，分别用 *（P < 0.05）、（P < 0.01）和*（P < 0.001）表示。

结果

1. 暴露于 1% CO₂激活了S. elongatus PCC 7942 的抗氧化防御反应：S. elongatus PCC 7942 先在大气 CO₂（~0.04% CO₂）条件下培养至 OD₇₃₀为 0.8，然后转移到含有 1% CO₂的大气中，其他培养条件不变。结果发现，暴露于 1% CO₂后，培养物的 pH 在 4 h 内从～11 降至～7。转移到 1% CO₂后，S. elongatus PCC 7942 的光合自养生长显著增强。在初始 0.04% CO₂生长阶段以及转移到 1% CO₂后 40 min 和 4 h 时，采集S. elongatus PCC 7942 的细胞进行转录组测序。与在 0.04% CO₂条件下生长的细胞相比，暴露于 1% CO₂ 40 min 和 4 h 的细胞中，分别有 477 和 654 个基因显著上调。KEGG 分析表明，暴露于 1% CO₂ 40 min 和 4 h 的细胞中，上调基因分别有 30% 和 57% 富集在能量和生物合成代谢中，包括光磷酸化、卡尔文循环和大分子生物合成，这与转移到 1% CO₂后生长增强的现象一致。

值得注意的是，与在 0.04% CO₂条件下生长的细胞相比，S. elongatus PCC 7942 暴露于 1% CO₂ 40 min 后，编码抗氧化防御反应相关酶的基因，如编码超氧化物歧化酶的Synpcc7942_0801以及编码过氧化物酶的Synpcc7942_1214、Synpcc7942_2309和Synpcc7942_2449的表达显著上调。这表明S. elongatus PCC 7942 短期暴露于 1% CO₂可能诱导了氧化应激，从而激活了抗氧化防御反应。考虑到暴露于 1% CO₂导致培养物 pH 迅速下降，为了确定氧化应激是由 1% CO₂还是 pH 下降引起的，研究人员测量了培养物暴露于 1% CO₂时的 ROS 丰度以及用 HCl 调节培养物 pH 至与暴露于 1% CO₂时相当的 pH 下降幅度时的 ROS 丰度。结果发现，用 HCl 调节 pH 时，ROS 丰度没有显著变化，而暴露于 1% CO₂时，ROS 丰度显著增加，这表明氧化应激是由 1% CO₂诱导的，与 pH 变化无关。此外，在细胞暴露于 1% CO₂ 40 min 的过程中，观察到 ROS 浓度逐渐增加，同时总还原硫醇池水平逐渐下降。总还原硫醇池水平的下降可能是由于伴随 ROS 清除过程中，谷胱甘肽（GSH）被氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），这一反应由基因Synpcc7942_1214（gpxA）编码的谷胱甘肽过氧化物酶催化。与在 0.04% CO₂采样的细胞相比，暴露于 1% CO₂ 40 min 的细胞中，gpxA的表达上调了近三倍。因此，<