一、研究背景
在自然环境中，卤代有机物广泛存在，对生态系统和人类健康构成严重威胁。1,1,1 - 三氯乙烷（1,1,1-TCA）和氯仿（CF）作为典型的卤代烃，曾在工业领域大量使用，由于过去不当的处置方式，如今已成为持久性的地下水污染物。这些物质化学性质稳定，碳 - 氯键牢固，难以被普通微生物降解，还会干扰许多生物过程，比如抑制产甲烷作用以及影响氯代乙烯的还原脱氯过程。
专性有机卤呼吸细菌（OHRB）在卤代有机物的生物转化和解毒过程中发挥着关键作用。它们能够利用卤代有机化合物作为电子受体，氢气（H2）或有机酸作为电子供体，通过还原脱氯作用将卤代有机物转化为相对无害的物质，同时获取生长所需的能量。其中，Dehalobacter（Dhb）是一类备受关注的 OHRB，可代谢多种卤代有机化合物，然而目前已知能降解 1,1,1-TCA 或 CF 的Dhb菌株仅有少数几株，且尚未发现能将 1,1,1-TCA 完全脱氯为无害终产物的菌株。此外，对于这些细菌在不同环境中的生态和进化方面的了解也十分有限。因此，从全球不同环境中分离和研究新型Dhb菌株意义重大，这不仅有助于深入理解其生态和进化机制，还能为开发卤代烃污染场地的生物修复技术提供新的思路和方法。
二、材料与方法
研究人员从中国北方受卤代烃和重金属污染的西河流域采集了沉积物样本。在厌氧培养箱中，将约 5g 的沉积物浆液加入到 120mL 的血清瓶中，瓶内充满氮气（N2）/ 二氧化碳（CO2）（80/20，体积比）的顶空，并添加 80mL 碳酸氢盐缓冲的矿物盐培养基，同时补充 5mM 乳酸、沃林维生素混合物以及 50μg/L 的维生素 B12。向血清瓶中分别加入纯净的 1,1,1-TCA（约 6μL 或 59.36μmol，0.52mM 水溶液浓度）和 H2（约 10mL / 瓶），作为电子受体和电子供体。当 1,1,1-TCA 被脱氯转化为 1,1 - 二氯乙烷（1,1-DCA）后，将培养物连续转移（3.75%，体积比）至新鲜的矿物盐培养基中，从而获得无固体的 1,1,1-TCA 脱氯富集培养物，同时设置添加 1,1,1-TCA 的高压灭菌培养物作为非生物对照。所有血清瓶均在 30°C、黑暗且不摇晃的条件下培养。
在实验过程中，研究人员进行了多项分析。当 1,1,1-TCA 完全脱氯后，收集微宇宙以及第二代和第六代培养物中的细胞，通过 0.22μm 的 MCE 滤膜过滤，然后使用 TIANamp 土壤 DNA 试剂盒提取基因组 DNA。对细菌和古菌 16S rRNA 基因的 V3 - V4 区域进行扩增，构建文库并在 Illumina MiSeq PE250/300 平台上进行测序。对于第十代培养物，采用美国能源部联合基因组研究所推荐的 CTAB 协议提取 DNA，构建文库后在 NovaSeq 6000 测序仪上进行宏基因组测序。对原始序列数据进行处理、组装、分类和注释，并评估宏基因组组装基因组（MAGs）的完整性和污染情况。在 1,1,1-TCA 和 CF 完全脱氯后，收获 640mL 富集培养物中的生物质，通过离心获取蛋白质，经胰蛋白酶消化、脱盐、浓缩后，使用 LC - MS/MS 在 Q Exactive HF 质谱仪上进行蛋白质鉴定分析。
三、研究结果
（一）还原脱氯过程
厌氧微宇宙中的 1,1,1-TCA 在 60 天的培养期内，主要被脱氯转化为 1,1-DCA，同时还检测到甲烷、1,1 - 二氯乙烯（1,1-DCE）、氯乙烯（VC）和乙烯等产物。经过连续转移后的富集培养物，在添加乳酸和 H2的条件下，能够在 2 周内将约 60μmol 的 1,1,1-TCA 高效脱氯为 1,1-DCA，脱氯速率高达 65μM / 天，且产生的 1,1-DCE 极少（<0.2μmol），几乎检测不到甲烷、VC 和乙烯。在非生物对照的高压灭菌微宇宙中，4 个月的监测期内，仅有不到 2% 的 1,1,1-TCA 被非生物转化为 1,1-DCE，且未检测到 1,1-DCA，这充分证明了 1,1,1-TCA 转化为 1,1-DCA 是生物反应过程。无固体的富集培养物还能够在 22 天内将约 62μmol 的 CF 脱氯转化为二氯甲烷（DCM），并在 130 天左右的监测期内，将 1,1,2-TCA 脱氯转化为 1,2 - 二氯乙烷（1,2-DCA）和 VC，二者比例接近 1:1。然而，对于其他氯代化合物，如四氯乙烯（PCE）、三氯乙烯（TCE）、1,2-DCA 和氯酚等，富集培养物在 160 天的监测期内无法对其进行脱氯。研究发现，添加维生素 B12的富集培养物中，1,1,1-TCA 的平均脱氯速率明显快于未添加维生素 B12的培养物，这表明维生素 B12对于 1,1,1-TCA 的还原脱氯过程至关重要。另外，添加乙酸盐和 H2的富集培养物，需要 1 个多月的时间才能将约 60μmol 的 1,1,1-TCA 转化为 1,1-DCA，平均脱氯速率仅为 14μM / 天。在所有的富集培养物中，1,1,1-TCA 的脱氯过程都存在约 1 周的延迟期，这与以往的研究结果一致。
（二）微生物群落结构变化
通过对脱氯细菌 16S rRNA 基因的聚合酶链反应（PCR）检测和 Sanger 测序，发现了Dhb种群的存在，这暗示Dhb可能参与了 1,1,1-TCA 的脱氯过程。进一步对微宇宙以及第二代和第六代培养物进行 16S rRNA 基因扩增子测序分析，结果显示在沉积物微宇宙、第二代和第六代培养物中，优势菌门主要包括Bacillota、Pseudomonadota、Bacteroidota和Chloroflexota，它们共占总序列的 91.9 - 96.4%。在富集培养物中，Bacillota（33.8 - 72.5%）和Bacteroidota（11.6 - 30.3%）始终是最丰富的菌门，而Pseudomonadota和Chloroflexota序列的相对丰度则从微宇宙中的 15.3% 和 12.5%，分别下降到第六代培养物中的 4.2% 和 0.2%。在属水平上，微宇宙中最丰富的操作分类单元（OTUs）属于Bacteroidota门中的Petrimonas（12.2%），但在第六代培养物中，Petrimonas序列的相对丰度较低（<1.4%）。Dhb序列在微宇宙中仅占总序列的 1.8%，然而经过连续转移后，其在第二代和第六代培养物中的相对丰度显著增加，分别达到 26.7% 和 46.5%，成为优势种群。此外，在第六代培养物中，Bacteroidales、Acetobacterium、Lentimicrobium、Desulfovibrio和Sedimentibacter等属的相对丰度也均高于 1.0%，Dhb与这五个属的总相对丰度达到 80.0%。Dehalococcoides（Dhc）在微宇宙和第二代培养物中也有检测到，但相对丰度较低（<1.6%），经过六次连续转移后则消失不见。这些结果表明，连续转移后Dhb丰度的显著增加，有力地证明了Dhb在 1,1,1-TCA 脱氯过程中发挥了重要作用。
（三）Dhb生长与还原脱氯的耦合关系
在富集培养物中，1,1,1-TCA 脱氯转化为 1,1-DCA 的过程存在 6 - 10 天的延迟期，在延迟期内未观察到Dhb的生长。当初始的 1,1,1-TCA 被消耗完后，在第十三代培养物中，每毫升Dhb 16S rRNA 基因的拷贝数从初始的 8.28±0.69×105增加到 5.67±0.29×107，增长了 68.4 倍。在将约 60μmol 的 1,1,1-TCA 按化学计量转化为 1,1-DCA 的过程中，Dhb的平均生长产量为 7.53±0.38×107个细胞 /μmol 释放的氯。而在未添加 1,1,1-TCA 的培养物中，Dhb细胞密度几乎没有增加。这一系列结果表明，Dhb种群的生长与 1,1,1-TCA 脱氯转化为 1,1-DCA 的过程存在紧密的耦合关系。进一步通过定量 PCR 检测发现，在 CF 脱氯转化为 DCM 以及 1,1,2-TCA 脱氯转化为 1,2-DCA/VC 的过程中，Dhb的生长产量分别为 1.41±0.33×108和 3.02±0.01×107个细胞 /μmol 释放的氯，与其他已研究的Dhb菌株的生长产量大致相当。
（四）宏基因组组装基因组分析
对 1,1,1-TCA 脱氯富集培养物进行宏基因组测序，结果显示在属水平上，富集培养物主要由Dhb、Sedimentibacter、Acetobacterium、Propionicimonas和Lentimicrobium等属主导，这与 16S rRNA 基因扩增子测序的结果相吻合。共组装得到 105,431 个重叠群，其中 54,766 个重叠群长度≥500bp，N50为 7,587bp，最大的重叠群长度为 722,444bp。注释后发现了 91,990 个推定基因，其中仅有 8 个还原脱卤酶（RDase）基因。通过 Maxbin2 软件，成功回收了 13 个高质量的 MAGs（完整性≥90%，污染≤5%）和 9 个中等质量的 MAGs（完整性≥50%，污染≤10%）。
在这些 MAGs 中，有一个对应于Dhb的高质量 MAG，命名为菌株 T。菌株 T 的基因组由 65 个重叠群组成，总大小为 3,006,140bp，G + C 含量为 44.5%，N50值为 99,524bp。CheckM 分析表明，该草图基因组的完整性几乎达到 99.9%，污染率仅为 0.3%，且在其草图基因组中只发现了一个全长为 1,564bp 的 16S rRNA 基因。系统发育分析显示，菌株 T 与D. restrictus菌株 PER - K23 的 16S rRNA 基因序列相似度高达 100%，进一步的最大似然系统发育分析也证实了二者之间的密切关系。通过对不同Dhb菌株的比较基因组分析发现，基因家族分布存在显著差异，共鉴定出 4,241 个基因家族，其中有 400 个基因家族的拷贝数发生了显著的扩张或收缩，且基因家族收缩的情况更为普遍。菌株 T 的基因家族收缩数量（141 次）明显高于菌株 CF（39 次）和 UNSWDHB（51 次），与菌株 PER - K23（91 次）更为相似。这表明基因家族的动态变化，尤其是基因家族的收缩，可能在这些细菌菌株的适应性进化和生态位特化过程中发挥了重要作用。
在菌株 T 的基因组中，鉴定出了 8 个推定的rdhA（RDase 的催化亚基）基因，且这些基因均被归类到菌株 T 的草图基因组中，这意味着在富集培养物中只有一个Dhb种群具有功能性的 RDases，并负责还原脱氯过程。分析发现，菌株 T 由于缺失了参与从头合成咕啉环的cbiK、cbiX和cobR基因，不具备完整的钴胺素合成途径，这与培养过程中对维生素 B12的需求相吻合，因为维生素 B12对于 RDases 的功能至关重要。此外，与菌株 PER - K23 类似，菌株 T 的基因组预测编码 8 种不同的氢化酶，包括 3 种周质膜结合的 Ni/Fe 摄取氢化酶（Hup）、2 种类似于Dhc菌株 195 中 Hyc 和 Ech 簇的六亚基膜结合能量守恒 Ni/Fe 氢化酶，以及 3 种 Fe - 仅氢化酶（Hym）。同时，在菌株 T 的基因组中还鉴定出一种甲酸脱氢酶，它由膜结合的 b 型细胞色素、Fe/S 簇蛋白和催化亚基组成，是一种钼硒蛋白酶，在假定的活性位点含有硒代半胱氨酸，与Dhc菌株 CBDB1 中不含硒代半胱氨酸的 OmeA 钼酶（先前注释为甲酸脱氢酶）仅具有 35.2% 的相似性。推测菌株 T 可能也能够利用甲酸作为电子供体，但这还需要在菌株 T 被成功分离后进一步通过实验验证。
（五）微生物间的相互作用
在 1,1,1-TCA 脱氯富集培养物中，除了Dhb外，还鉴定出了一些非脱氯种群，如Bacteroidales、Sedimentibacter、Propionicimonas、Acetobacterium和Lentimicrobium等。这些微生物可能为Dhb提供必需的碳源、钴胺素或氨基酸。宏基因组分析发现，Sedimentibacter的草图基因组中含有完整的钴胺素生物合成途径，能够弥补菌株 T 无法合成钴胺素的缺陷。实验证实，在未添加维生素 B12的富集培养物中，1,1,1-TCA 的还原脱氯过程依然能够发生。在 1,1,1-TCA 脱氯的延迟期内，观察到乳酸发生了显著转化，几乎完全转化为丙酸和乙酸，二者的摩尔比约为 2:1。基因组分析表明，Propionicimonas的草图基因组中存在完整的乳酸分解代谢途径，能够将乳酸转化为丙酸和乙酸，这与之前关于Propionicimonas paludicola的报道一致，该菌是一种兼性厌氧、产丙酸的细菌，能够利用乳酸或葡萄糖产生丙酸和乙酸，比例为 2:1。同样，Lentimicrobium和Bacteroidales作为发酵细菌，也具有利用乳酸产生乙酸和 H2的能力。Bacteroidales是 1,1,1-TCA 脱氯富集培养物中最丰富的非脱氯微生物，这与之前在 ACT - 3 菌群中发现发酵性Bacteroidales菌株 CF 占优势且能还原脱氯 1,1,1-TCA、1,1-DCA 和 CF 的研究结果相符。遗憾的是，Lentimicrobium和Bacteroidales<
