Siglec靶向脂质体揭示致命真菌病原体表面唾液酸聚糖的分布特征及其抗真菌应用

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Siglec-targeted liposomes to identify sialoglycans present on fungal pathogens

本研究创新性地利用Siglec-3（SIG3）和Siglec-15（SIG15）修饰的两性霉素B（AmB）负载脂质体（SIG3-Ls/SIG15-Ls），首次在毛霉（Rhizopus delemar）和曲霉（Aspergillus fumigatus）菌丝体细胞壁发现连续分布的N-连接唾液酸糖蛋白层。通过酶解实验证实其结合依赖Neu5Ac特异性识别，Western blot鉴定出多种真菌唾液酸糖蛋白。靶向脂质体在亚微摩尔浓度下显著增强抗真菌效果，为侵袭性真菌病治疗提供新策略。

　　ABSTRACT
研究团队通过提取Siglec-3和Siglec-15的胞外V区Ig样C2配体结合域及茎区，将其修饰于负载两性霉素B（AmB）和罗丹明B的脂质体表面，构建出SIG3-Ls和SIG15-Ls两种探针。这些工具被用于解析两种进化距离遥远的致命病原真菌——毛霉（Rhizopus delemar）和曲霉（Aspergillus fumigatus）的唾液酸聚糖分布特征。

INTRODUCTION
侵袭性曲霉病和毛霉菌病死亡率高达70%，年死亡病例超200万例。传统抗真菌药物如脂质体AmB（AmBisome）疗效有限，而真菌表面唾液酸聚糖可能参与致病过程。研究团队此前已证实Dectin靶向的DectiSomes能有效杀灭真菌，本研究转向唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）家族，重点关注偏好N-连接结构的SIG3和偏好O-连接结构的SIG15。

MATERIALS AND METHODS
通过大肠杆菌表达系统制备截短的Siglec蛋白，采用6M盐酸胍（GuHCl）变性/复性策略纯化，并通过DSPE-PEG-3400-NHS将其锚定于脂质体膜。每个100nm脂质体携带约1,200个Siglec分子、3,000个荧光标记和16,500个AmB分子。结合实验使用固定后的真菌琼脂块，通过CellProfiler定量荧光信号；杀伤实验采用CellTiter-Blue检测代谢活性。

RESULTS

1. 结合特征
   SIG3-Ls/SIG15-Ls在毛霉萌发管和菌丝表面形成连续结合层，但对孢子结合较弱；而在曲霉中则对分生孢子和菌丝均有强结合。定量显示SIG3-Ls对毛霉菌丝结合效率达6万倍于对照（P_MW<0.0001），对曲霉分生孢子结合强6.6万倍（P=0.0025）。

2. 特异性验证
   神经氨酸酶（sialidase AU）和PNGase F处理使结合信号降低>95%，证实其依赖Neu5Ac修饰的N-连接糖蛋白。Western blot鉴定出15-75kDa范围的多种真菌唾液酸糖蛋白。

3. 抗真菌效果
   0.8μM AmB剂量下，SIG3-Ls使毛霉代谢活性降低20.2倍（P=6.6×10^-14）；对曲霉0.4μM剂量即显示2.4倍抑制（P=1.4×10^-7），显著优于未靶向脂质体。

DISCUSSION

1. 进化意义
   毛霉与曲霉分化达8-14亿年，但均保守表达唾液酸糖蛋白，提示该特征可能在真菌界广泛存在。与DectiSomes结合外多糖基质不同，Siglec靶向脂质体直接结合细胞壁糖蛋白，为真菌表面糖基化研究提供新视角。

2. 致病机制
   既往研究显示唾液酸聚糖可减少吞噬作用，本研究首次在菌丝体细胞壁发现连续唾液酸层，可能通过空间位阻保护真菌免受免疫攻击。

3. 治疗应用
   尽管结合更接近细胞膜，Siglec靶向脂质体的杀伤效率仍逊于Dectin靶向系统，可能与唾液酸糖蛋白的膜嵌入深度或AmB释放动力学相关，这为下一代靶向设计提供优化方向。

CONCLUSION
该研究首次绘制出两种致命真菌细胞壁唾液酸糖蛋白的空间分布图谱，证实Siglec靶向策略可增强抗真菌药物递送效率，为侵袭性真菌病治疗开辟新途径。