从血清样本分离钩端螺旋体，揭示哥斯达黎加钩体菌群多样性

《Scientific Reports》：In-house isolation protocol from human serum samples demonstrates the circulating of a broad diversity of Leptospira serogroups in Costa Rica

为解决钩端螺旋体（Leptospira）分离难题，研究人员开展从血清样本分离培养研究，发现多样菌群，助力诊断。

　　钩端螺旋体病（Leptospirosis）是一种广泛传播的人畜共患病，由钩端螺旋体属（Leptospira）的致病性细菌引起。在热带和亚热带地区，由于降雨充沛、洪水频发，这种疾病的发病率居高不下，每年全球估计有超过一百万例病例，约 60000 人因此丧生。钩端螺旋体病的症状多样，从急性发热、全身不适、关节疼痛、头痛等非特异性症状，到严重时可发展为多器官功能衰竭，如肾衰竭和黄疸（即 “韦尔综合征（Weil Syndrome）”），死亡率在 5% - 50% 之间。而且，由于其症状与登革热、疟疾等其他发热性疾病相似，在热带地区常常被误诊。

哥斯达黎加就是这样一个钩端螺旋体病的流行国家。那里有着多样的微气候，每年五月到十一月的漫长雨季常引发洪水，为钩端螺旋体的传播创造了理想环境。此前，当地就曾出现过与洪水相关的钩端螺旋体病爆发事件，也从患者体内分离出多种钩端螺旋体菌株，但对当地钩端螺旋体的流行情况仍缺乏全面了解。

为了更深入地探究钩端螺旋体在流行地区的传播和分布情况，来自哥斯达黎加营养与健康研究教育学院（INCIENSA）国家细菌学参考中心人畜共患发热疾病实验室、法国巴斯德研究所螺旋体生物学单位等机构的研究人员，开展了一项极具意义的研究。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是实时荧光定量 PCR 技术（real-time PCR），用于检测血清样本中钩端螺旋体的 DNA；二是微凝集试验（MAT），对分离出的菌株进行血清型鉴定；三是全基因组测序分析（Whole-genome sequencing analysis），确定菌株的种类和基因特征。研究样本来自 2020 年 11 月至 2021 年 12 月间，哥斯达黎加疑似钩端螺旋体病患者急性期（症状出现后 1 - 6 天）的 730 份血清样本。

下面来看看具体的研究结果：

1. 血清学诊断结果：在 730 份血清样本中，通过血清学检测，只有 41 份（5.6%）样本的钩端螺旋体 IgM ELISA 检测呈阳性，而所有样本的微凝集试验（MAT）检测均为阴性。
2. 分子检测结果：利用实时荧光定量 PCR 技术对 730 份血清样本进行检测，发现 42 份（5.7%）样本中存在致病性钩端螺旋体的 DNA 扩增。其中，7 例（16%）PCR 阳性患者的 ELISA 钩端螺旋体 IgM 检测也呈阳性。
3. 菌株分离结果：对 31 份 PCR 阳性且保存于 4°C 的血清样本进行培养，最终成功分离出 11 株钩端螺旋体菌株，分离率为 35.4% 。这些菌株在不同培养基中均有生长，从样本采集到培养阳性的平均时间为 7.45 周。而且，研究发现样本中细菌数量与分离成功与否似乎并无直接关联。
4. 血清型鉴定结果：通过微凝集试验，研究人员将这 11 株钩端螺旋体菌株鉴定为 6 个不同的血清群，分别是 Hebdomadis、Shermani、Tarassovi、Pyrogenes、Grippotyphosa 和 Ballum 。这表明哥斯达黎加存在多种不同血清群的钩端螺旋体菌株在流行。
5. 全基因组特征分析结果：全基因组测序分析显示，10 株菌株被鉴定为 Santarosai 钩端螺旋体（Leptospira santarosai），1 株为 borgpetersenii 钩端螺旋体（Leptospira borgpetersenii）。这些菌株的基因组特征各不相同，除了 1 株 Leptospira borgpetersenii 与其他地区的菌株有匹配外，其余均为新的序列类型，反映出钩端螺旋体在基因层面的多样性。

综合研究结论和讨论部分来看，这项研究具有重要意义。一方面，研究证明了血清是用于钩端螺旋体分离的合适样本，即使血清样本在 4°C 保存数天，仍能成功分离出钩端螺旋体，这为全球参考实验室使用血清进行钩端螺旋体分离提供了有力支持。另一方面，研究揭示了哥斯达黎加存在多种不同血清群和种类的钩端螺旋体，这与当地丰富的生态多样性和潜在的动物宿主多样性相关。通过对这些菌株的研究，有助于进一步了解钩端螺旋体病的传播途径和发病机制，为制定更有效的防控策略和诊断方法提供依据。此外，研究还发现了不同血清群与潜在动物宿主之间的关联，这对于追溯感染源、预防疾病传播具有重要价值。但研究也存在一定局限性，如使用 secY 作为检测急性钩端螺旋体病的靶点，对部分致病性中等的钩端螺旋体检测灵敏度较低，未来还需探索更有效的检测靶点。总体而言，这项研究为钩端螺旋体病的研究和防控开辟了新的方向，具有重要的科学价值和实际应用意义。