编辑推荐：
这篇综述聚焦心血管疾病相关非编码遗传变异，阐述其致病机制、研究方法，着重介绍 hiPSC 模型在研究中的应用，涵盖心脏发育、心律失常等疾病，探讨模型优势与局限，对心血管疾病研究及诊疗意义重大。
心血管疾病与非编码遗传变异的研究背景
心血管疾病是全球范围内导致死亡的主要原因之一，遗传易感性在其发病风险中起着关键作用。随着基因组学技术的发展，如下一代测序和全基因组关联研究（GWASs），大量与心血管疾病相关的遗传位点被发现。然而，令人惊讶的是，大多数已识别的遗传变异位于非编码基因组区域，这些区域虽然不直接改变蛋白质编码序列（外显子），但却对心脏的发育和功能至关重要。它们通常存在于调控 DNA 元件，如启动子、增强子和沉默子中，以及对基因组三维（3D）结构关键的区域，参与精确的转录时空调控过程。
但非编码区域的复杂性给研究带来了巨大挑战，难以确定哪些变异具有致病性以及它们如何导致心脏功能障碍。同时，这也阻碍了疾病预测和预后在临床的常规应用。理解非编码变异的影响需要对转录组和表观基因组进行研究，这在技术和资金上都颇具负担，而且许多非编码变异的影响还可能依赖于个体的基因组背景。在这种情况下，人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）作为一种强大的研究工具应运而生，它能够在人类心肌细胞的背景下研究遗传变异对心血管疾病的影响。
非编码变异的致病机制
转录是基因表达的起始步骤，是一个受到高度调控的过程。增强子作为保守的 DNA 元件，通过含有特定转录因子（TF）的结合位点，在长距离的基因组上发挥精确的时空调控作用。这些转录因子结合增强子后，招募共激活因子，使增强子与启动子区域相互靠近，形成染色质环，促进转录起始。此外，组蛋白修饰通过调节染色质的紧密程度，影响 DNA 的可及性，从而对基因表达进行调控。
非编码变异可以通过多种途径导致疾病。在转录过程中，一些非编码变异位于功能性调控元件（REs）内，能够改变转录因子的结合亲和力或表达水平。例如，许多与心血管疾病相关的非编码变异会影响关键心脏转录因子，如 NKX2.5、TBX5、ETS TF 家族成员和 MEF2 等的结合亲和力。转录因子通过其 DNA 结合域识别特定的短 DNA 序列（基序），非编码变异若改变了基序中保守核苷酸，就可能影响转录因子的结合，进而改变靶基因的表达水平。而且，非编码变异还可能引入新的转录因子结合位点，导致替代转录程序的出现。
在染色质结构方面，非编码变异可以破坏预先存在的拓扑相关结构域（TADs），影响染色质的三维构象。TADs 内的染色质环使调控元件与靶基因靠近，促进转录调控。而破坏这些区域会导致染色质重组，在心肌病和心力衰竭中，就发现了此类区域的破坏引发的表观基因组重编程。
此外，非编码变异还能影响转录后过程。位于外显子 - 内含子交界处附近的非编码变异可通过可变剪接或异常剪接，影响基因的特定转录本表达，如与肥厚型心肌病相关的 MYBPC3 变异。靠近 5' 和 3' 非翻译区的非编码变异则会干扰 mRNA 的稳定性和加工过程，影响多聚腺苷酸化和核糖体结合等。
研究非编码变异机制的方法
由于基因组中近 98% 为非编码 DNA，对其研究需要运用多种检测方法。在确定候选因果变异后，研究非编码变异影响的方法主要包括以下几类：
- 转录组学：通过比较携带非编码变异的细胞和对照细胞中差异表达的基因，可以了解非编码变异影响的基因和通路。RNA 测序作为一种无偏的高通量方法，有助于全面分析基因表达变化。而单细胞 RNA 测序则能进一步揭示非编码变异在不同细胞或状态下的特异性影响。此外，将 RNA 测序与个体基因型相结合，能够生成表达数量性状位点（eQTL）数据，从群体水平衡量遗传变异对基因表达的影响，cis-eQTLs 可研究邻近基因的表达，trans-eQTLs 则可研究可能间接受影响的远端基因。
- 转录因子结合和表观基因组学：研究转录因子结合时，通常先使用计算工具筛选已知和新的转录因子基序，然后通过染色质免疫沉淀和 qPCR（ChIP-qPCR）或染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）进行验证。ChIP-qPCR 用于定量特定 DNA 区域的转录因子结合，ChIP-seq 则可进行全基因组范围的分析。此外，还有如 CUT&Tag 和 CUT&RUN 等更简化的染色质分析技术。电泳迁移率变动分析（EMSA）可在体外进一步研究转录因子与特定 DNA 序列的结合偏好。
在研究染色质可及性和组蛋白修饰方面，常见的组蛋白标记如乙酰化组蛋白 3 赖氨酸 27（H3K27ac）、H3K4 单甲基化（H3K4me1）、H3K4me3 和 H3K27me3 等，与染色质的活性和基因表达密切相关。但组蛋白修饰通常覆盖较大的 DNA 区域，对于确定细胞类型或实验组之间差异可及的较小 DNA 调控元件作用有限。此时，可利用转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）或靶向可及染色质切割技术来补充组蛋白修饰数据，通过生物信息学分析差异可及区域，推断与之结合的转录因子。
研究染色质环和结构时，3D 染色质构象检测方法可进一步阐明候选调控区域与靶基因之间的关系。Hi-C 技术结合了染色体构象捕获（3C）技术和高通量测序，能够测量基因组位点之间的成对接触，生成 3D 染色质组织图谱，揭示调控元件与基因启动子之间的相互作用，以及非编码变异对这些相互作用的影响。
对于候选调控元件（如增强子），需要进行功能验证。荧光素酶报告基因检测是常用的方法，通过将候选增强子序列克隆到荧光素酶报告质粒中并导入细胞，测量荧光素酶活性的变化，可评估增强子的功能活性以及序列变异对其的影响。大规模平行报告分析（MPRA）则是一种高通量检测方法，可同时研究数千个候选调控元件。此外，自我转录活性调控区域测序（STARR-seq）通过使用随机基因组 DNA 片段，更无偏地识别功能性增强子。近年来，CRISPR 技术的发展为表观遗传研究提供了有力工具，如 CRISPR 干扰（CRISPRi）可用于在体外和体内对候选调控区域进行功能验证。
hiPSC 模型在心血管疾病研究中的应用
hiPSC-CMs 在心血管疾病研究中具有独特优势，其基因表达与心脏组织样本相似，尤其是与基因型 - 组织表达（GTEx）项目中的左心室组织的 eQTLs 高度一致，这使得 hiPSC-CMs 成为研究非编码变异对基因表达影响的有效模型。研究人员已经利用 hiPSC-CMs 生成了大量的表观基因组数据集，包括染色质环拓扑结构、染色质可及性图谱、组蛋白标记以及心脏转录因子的全基因组结合谱等。
在研究非编码变异与心血管疾病的关系方面，hiPSC-CMs 发挥了重要作用，具体体现在以下疾病的研究中：
- 心脏发育和先天性心脏病：先天性心脏病（CHD）每年影响 1% 的新生儿，与大量非编码变异相关。研究人员通过在 hiPSC-CMs 中使用慢病毒 MPRA（lentiMPRA）技术，对 750 个 CHD 三联体全基因组测序发现的 6,500 多个新非编码变异进行研究，确定了 403 个影响心脏调控元件活性的变异，并对其中 10 个进行深入研究，揭示了靶基因和变异介导的转录因子结合破坏机制。同时，利用这些数据开发了预测回归模型 EpiCard，用于优先筛选未来的非编码变异。
NKX2-5 作为心脏发育的关键转录因子，其功能异常与先天性心脏畸形和心律失常有关。研究发现，许多与心脏疾病相关的非编码变异可能改变 NKX2-5 的结合位点。通过整合多个 hiPSC-CM 系的基因组、转录组、表观基因组和 NKX2-5 结合数据集，研究人员鉴定出约 2,000 个对 NKX2-5 结合有等位基因特异性影响的单核苷酸变异，其中部分与心电图特征相关。对两个优先变异 rs3807989 和 rs590041 的实验验证表明，它们分别位于 NKX2-5 结合的功能性调控元件内，调节 SSBP3 和 CAV1/2 的表达，且 NKX2-5 在不同调控元件上可发挥激活或抑制作用。
此外，在研究窦房结（SAN）发育和功能时，研究人员开发了 hiPSC-based SAN 分化方案，获得大量不同 SAN 区域的起搏细胞，并通过单细胞 RNA 和 ATAC-seq 分析其分子特征，确定了各亚型特有的调控元件，发现 SAN 尾和过渡区的调控元件富含与静息心率相关的变异，而 SAN 头的调控元件则与运动后心率恢复相关的变异富集。
- 心律失常：心房颤动（AF）是最常见的心律失常之一，GWASs 显示其与非编码区域的变异密切相关。研究人员利用 hiPSC-CMs 研究发现，AF 相关的 rs2595104 变异位于 PITX2a/b 内含子区域的重要调控元件内，通过减少 TFAP2a 的结合，降低 PITX2c 的表达和调控元件活性。同时，破坏 4q25 位点 3D 染色质组织的变异也与心律失常有关，研究人员通过对携带 1.5 Mb 缺失的家庭进行研究，发现该缺失位于 PITX2 上游的基因沙漠中，导致 3D 染色质结构重组，进而影响 PITX2 在不同心肌细胞中的表达。
对于 Brugada 综合征（BrS），研究人员在东南亚患者中发现 SCN5A 基因内含子区域的一个罕见非编码增强子变异，该变异预测会破坏 MEF2 结合位点。将其引入 hiPSC-CMs 后，SCN5A 表达显著降低，INa电流密度下降 30%，为该变异在 BrS 中的作用提供了因果证据。
- 心肌病：肥厚型心肌病（HCM）是年轻人和运动员心源性猝死的常见原因，多由 MYBPC3 基因的致病性变异引起。研究人员利用 HCM 患者来源的 hiPSC-CMs，证实了 MYBPC3 基因中两个已知的剪接增益变异（c.1090 + 453C>T 和 c.1224 - 52G>A）导致的异常剪接，并发现了一个此前未明确的 HCM 遗传病因（c.1928 - 569G>T），通过反义寡核苷酸治疗，可抑制异常外显子剪接，为患者提供了潜在的个性化治疗方案。
在研究扩张型心肌病时，研究人员通过整合人类心脏样本和 hiPSC-CMs 的表观遗传和转录因子结合特征，确定了 MYH7 基<
