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本文通过一系列 CTCF 突变探究其与染色质的关系及对基因调控的作用。研究发现 CTCF 信号强度与染色质可及性、阻断黏连蛋白（cohesin）能力相关，突变影响转录网络等。该研究为理解 CTCF 功能及相关疾病机制提供重要依据。
CTCF 的重要作用及研究背景
CCCTC 结合因子（CTCF）是一种含十一个锌指结构的 DNA 结合蛋白，它与黏连蛋白（cohesin）协同，在染色质组织形成拓扑相关结构域（TAD）的过程中发挥关键作用，这一过程涉及环挤出机制，对基因调控意义重大。CTCF 在肿瘤抑制、大脑发育和神经疾病等方面也至关重要，其基因位点与多种癌症相关，相关突变还和智力障碍、小头畸形等有关。然而，此前对 CTCF 突变的研究存在不足，如降解模型无法分析基因组背景对其结合和功能的影响，基因编辑单个结合位点的方法费力且局限性大，且缺乏对癌症和神经发育障碍相关 CTCF 突变的综合分析。
研究方法
为深入探究 CTCF 的作用，研究人员构建了可诱导的小鼠胚胎干细胞（mESC）互补系统。该系统利用小分子生长素诱导降解标签（AID）技术，使内源性 CTCF 等位基因标记 AID 和增强型绿色荧光蛋白（eGFP），同时组成性表达生长素激活的泛素连接酶 TIR1。在此基础上，建立了拯救系统，通过四环素调控元件（Tet O -3G）和反式激活因子（rtTA3G）实现对野生型或突变型 Ctcf 转基因的诱导表达，并借助 3 x FLAG 标签和 mRuby 荧光标签区分和检测转基因 CTCF。研究人员选取了 9 个高频癌症相关且部分与神经发育障碍（NDDs）相关的 CTCF 突变进行研究，涵盖多种影响锌指结构与 DNA 结合的氨基酸突变类型。
研究结果
- CTCF 突变体的染色质结合特性：研究发现，CTCF 突变体在基因组上的结合位点呈现独特的变化，包括失去、保留和获得部分结合位点。保留的结合位点多位于可及性高、CTCF 信号强的区域，且突变体结合的新位点（de novo 位点）其基序与野生型有所不同，这与突变影响锌指与 DNA 的相互作用有关。例如，K365T 突变导致与特定 DNA 碱基的氢键丢失，进而改变了结合基序。
- CTCF 与染色质可及性的关系：CTCF 结合会降低染色质的可及性，且这种降低依赖于 cohesin。在野生型和突变型 CTCF 结合位点，可及性均在 SMC3（cohesin 的一个亚基）存在时降低，且不同突变体降低可及性的能力存在差异，表明 CTCF 与可及性之间存在双向关系。
- CTCF 突变对其动力学特性的影响：通过荧光漂白恢复实验（FRAP）发现，所有突变体的 CTCF 与 DNA 的结合稳定性均发生改变，表现为驻留时间和 / 或结合分数降低。不同突变体的影响方式各异，如 Q418R 突变体结合位点数量中等但驻留时间极短，R448Q 突变体结合位点少但驻留时间与野生型相近。这表明 CTCF 的靶向搜索与结合稳定性可以解耦。
- CTCF 突变对 DNA - CTCF 复合物结构的影响：利用 AlphaFold3 预测发现，多数突变对 CTCF 整体构象影响较小，但 Q418R 突变体与野生型的均方根偏差（RMSD）相对较高。部分直接与 DNA 接触的氨基酸突变导致氢键丢失或增强，如 K365T、R339Q、R448Q 突变体氢键丢失，Q418R 突变体氢键增加，这在一定程度上解释了其结合特性的差异。
- CTCF 突变对基因表达和转录因子结合的影响：RNA 测序分析表明，CTCF 突变会导致基因表达发生变化，涉及癌症、大脑、免疫和代谢等多个功能通路，且不同突变体影响的基因表达变化具有独特性。同时，突变还会改变转录因子（TF）的结合，通过足迹分析发现，众多 TF 的结合发生改变，且这些变化与基因表达的改变密切相关，很多突变介导的转录变化是由 TF 通路的间接效应引起的。
- CTCF 突变对细胞分化的影响：研究发现，CTCF 突变会影响细胞从多能性退出和分化的轨迹。不同突变体在白血病抑制因子（LIF）撤出后，表现出与野生型不同的分化轨迹，涉及多个发育相关基因的差异表达，这些基因与神经发育障碍、先天性结缔组织综合征等多种疾病相关。
- CTCF 突变对染色质相互作用和绝缘性的影响：Hi - C 实验显示，CTCF 突变会改变染色质的相互作用和绝缘性。突变体的染色质相互作用图谱独特，驻留时间与染色质相互作用和绝缘分数相关，且强 CTCF 信号与更高的绝缘性相关，进一步表明 CTCF 在维持染色质结构和功能方面的重要作用。
研究结论
本研究通过多种实验方法，深入分析了 CTCF 突变对其与染色质相互作用及基因调控的影响。研究表明，CTCF 与染色质之间存在双向关系，其结合特异性受锌指与 DNA 序列相互作用及染色质可及性的影响。CTCF 突变对基因表达的影响主要通过间接效应实现，涉及 TF 结合的改变。此外，CTCF 突变还影响细胞分化轨迹，为理解相关疾病的发病机制提供了新的视角。然而，该研究也存在一定局限性，如转基因表达水平低于内源性 CTCF 可能导致对高亲和力结合位点的偏向性分析，Hi - C 数据分辨率有限可能低估 CTCF 环依赖的表达变化等。未来研究可进一步优化实验方法，深入探究 CTCF 在不同生理和病理条件下的作用机制。
