CUL1?neddylation 介导的 p27 降解：肝癌索拉非尼耐药新机制及潜在治疗策略

《Cell Biology and Toxicology》：CUL1-neddylation contributes to K29-linked ubiquitination on p27 for autophagic degradation in sorafenib-resistant liver cancer

肝癌是恶性程度高、预后差的消化系统肿瘤，索拉非尼（sorafenib）治疗易产生耐药性。哈尔滨医科大学附属肿瘤医院的研究人员针对索拉非尼耐药机制展开研究，发现阻断 neddylation 或自噬可恢复耐药细胞对索拉非尼的敏感性，为克服耐药提供了新策略。

　　肝癌，这一消化系统的 “夺命杀手”，严重威胁着人类的健康。据 2023 年数据显示，约 41,210 例新发病例，预计导致 29,380 人死亡，其中肝细胞癌（HCC）占比超 90% 。由于症状不典型，多数患者确诊时已处于晚期，5 年生存率低至 10%。索拉非尼作为一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，虽能抑制肿瘤细胞增殖和血管生成，显著延长晚期 HCC 患者的总生存期和无进展生存期，但其广泛应用常引发耐药问题，且耐药机制至今不明，这极大地阻碍了肿瘤治疗的进程。

为了攻克这一难题，哈尔滨医科大学附属肿瘤医院的研究人员开展了一项深入研究，相关成果发表在《Cell Biology and Toxicology》杂志上。该研究致力于揭示肝癌对索拉非尼产生耐药性的分子机制，探索克服耐药的潜在策略，为肝癌治疗开辟新道路。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先，从公共数据库（如 Gene Expression Omnibus、TCGA、cBioPortal）获取转录组数据和生存数据，利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选关键基因。然后，培养肝癌细胞系（HepG2 和 Huh7），构建索拉非尼耐药细胞模型。同时，运用蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测蛋白和基因表达水平，通过细胞计数试剂盒 8（CCK-8）、EdU 细胞增殖实验、Transwell 实验等评估细胞增殖、侵袭能力，还进行了体内肿瘤异种移植实验验证研究结果。

下面来看具体的研究结果：

1. 鉴定与索拉非尼耐药相关的关键基因：通过对 GSE109211 数据集进行 WGCNA 分析，发现棕色模块与索拉非尼无应答者相关性最强。进一步确定 35 个关键基因，并构建蛋白质 - 蛋白质相互作用网络，筛选出 8 个高连接度基因，包括 CUL1、SKP2、NBR1、NEDD8 等。富集分析表明，无应答者中上调基因与蛋白质 neddylation、泛素化、翻译后修饰和自噬相关。在 GSE144269 和 TCGA 队列中，CUL1、SKP2 和 NEDD8 在癌组织中高表达，且与不良预后相关。对 10 例 HCC 患者组织分析发现，CUL1 和 SKP2 在索拉非尼耐药肿瘤组织中表达更高。
2. CUL1 参与肝癌对索拉非尼的耐药过程：研究人员成功构建了索拉非尼耐药细胞系（HepG2-SR 和 Huh7-SR），这些耐药细胞在高剂量索拉非尼处理下，细胞活力、增殖、集落形成和侵袭能力均优于亲本细胞。在耐药细胞中敲低 CUL1 后，索拉非尼对细胞的抑制作用显著增强，表明 CUL1 参与了肝癌对索拉非尼的耐药过程。
3. CUL1 neddylation 介导索拉非尼耐药肝癌细胞中 p27 的泛素化：SCF 复合物（CUL1 和 SKP2 是其关键组分）是 Cullin - RING E3 泛素连接酶的一种亚型，p27 是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，可抑制细胞增殖。在索拉非尼耐药细胞中，SCF 复合物相关蛋白表达增加，研究人员推测 p27 可能因 CUL1 neddylation 介导的泛素化而降解。实验发现，用 neddylation 抑制剂 MLN4924 处理耐药细胞后，NEDD8 和 CUL1 表达下降，p27 表达恢复，且 p27 的泛素化水平降低，表明 CUL1 neddylation 介导了 p27 的泛素化和降解。
4. 索拉非尼耐药肝癌细胞中的自噬异常活跃：研究发现，与自噬相关的基因（如 NBR1、SQSTM1、OPTN 和 NDP52）在肿瘤组织中表达增加，且在索拉非尼耐药肿瘤组织中 mRNA 水平进一步升高，但 NBR1 和 SQSTM1 的蛋白水平却降低。通过 mCherry - /eGFP - LC3B 双荧光自噬检测系统发现，索拉非尼耐药细胞的自噬活性高于亲本细胞。自噬抑制剂巴氟霉素 A1（BafA1）和激活剂雷帕霉素（RAP）处理实验表明，NBR1 和 SQSTM1 在耐药细胞的溶酶体中被降解，且 p27 蛋白水平与自噬增强有关。
5. CUL1 诱导 p27 的 K29 连接泛素化，导致其在索拉非尼耐药肝癌细胞中发生自噬性降解：研究人员推测 CUL1 neddylation 介导的泛素化导致 p27 在耐药细胞中通过自噬途径降解。实验显示，MLN4924 可促进自噬体形成，但不能有效促进自噬通量。用 BafA1 或蛋白酶体抑制剂 MG132 预处理细胞后发现，自噬在 p27 蛋白降解中起更重要作用。敲低自噬受体 NBR1 和 SQSTM1 可诱导 p27 表达，其中 NBR1 的作用更明显。通过转染野生型和突变型 HA 标记的泛素，确定 CUL1 主要诱导 p27 的 K29 连接泛素化，且 K29 连接的泛素化促进了 p27 与 NBR1 和 SQSTM1 的结合，进而促进其自噬性降解。
6. 阻断 neddylation 和 CUL1 - NBR1 可恢复索拉非尼耐药细胞的药物敏感性：在索拉非尼耐药细胞中，添加 neddylation 抑制剂 MLN4924 或敲低 CUL1 可恢复细胞对索拉非尼的敏感性，抑制细胞增殖、集落形成和侵袭，阻止 p27 降解。两者联合使用效果更显著。体内实验也证实，敲低 CUL1 可增强索拉非尼对肿瘤的抑制作用，降低增殖标记物 ki67 的表达，增加 p27 表达。但过表达 NBR1 和敲低 p27 可逆转这种药物敏感性恢复的效果。

综合上述研究，研究人员揭示了索拉非尼耐药肝癌细胞中，自噬促进了 CUL1 - neddylation 介导的 p27 降解。NEDD8 介导的 CUL1 neddylation 修饰增强了 SCF 泛素连接酶复合物对 p27 的靶向作用，诱导 K29 连接的多聚泛素链添加到 p27 上，NBR1 通过增强自噬通量促进泛素化 p27 蛋白的降解，最终导致肝癌细胞对索拉非尼产生耐药性。而阻断 neddylation 或自噬能够恢复药物敏感性，这为未来实现有效的抗肿瘤治疗提供了新的策略，有望为肝癌患者带来新的希望，推动肝癌治疗领域的发展 。