奶牛乳腺炎症中血液和乳汁来源中性粒细胞的代谢表型差异及免疫功能研究

《Scientific Reports》：Metabolic phenotype of bovine blood-derived neutrophils is altered in milk

为探究健康与炎症状态下奶牛乳腺中白细胞亚群及功能差异，研究发现乳汁中性粒细胞代谢表型改变，意义重大。

　　在奶牛养殖过程中，乳腺健康至关重要。健康的乳腺中，外周血的免疫细胞会少量迁移至乳腺组织进行免疫监测，不会引发炎症；然而，当乳腺发生炎症时，大量白细胞会被招募，导致严重炎症。目前，关于奶牛乳腺炎症中不同来源的中性粒细胞功能及代谢状态，仍存在许多未知。比如，奶牛调节性中性粒细胞在炎症，尤其是乳腺炎症中的存在及潜在作用，很大程度上尚未被探索。为了解决这些问题，来自德国路德维希 - 马克西米利安大学（Ludwig - Maximilians - University Munich）的研究人员开展了一项针对健康和发炎乳腺腺区的乳汁细胞（主要是中性粒细胞）与血液来源中性粒细胞的研究，对比它们的免疫效应功能和代谢表型。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员在本次研究中，主要运用了流式细胞术、Seahorse XFe 分析仪检测技术等关键方法。研究样本来自 15 头奶牛，包含不同品种（褐牛 12 头、西门塔尔牛 3 头）和不同泌乳阶段（早期 5 头、中期 1 头、晚期 9 头）。通过对血液、健康乳腺腺区乳汁和发炎乳腺腺区乳汁样本进行分析，来探究中性粒细胞的相关特性。

研究结果如下：

1. 血液和乳汁细胞中白细胞亚群的差异：利用流式细胞术分析发现，健康和感染乳腺腺区的血液细胞与乳汁细胞中，存活的 CD45 白细胞亚群组成不同。血液来源细胞有明显的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群体；健康乳腺腺区中淋巴细胞占主导，而发炎腺区主要是粒细胞。进一步研究发现，健康乳腺腺区中 CD4⁺T 淋巴细胞和 CD8⁺T 淋巴细胞的百分比显著高于血液和发炎腺区，且发炎腺区的 CD4⁺:CD8⁺比值更低。此外，发炎腺区的单核细胞 / 巨噬细胞（CD172aCD14⁺）百分比低于血液，而中性粒细胞（CH138A⁺）百分比更高。同时，还观察到乳汁来源的白细胞与血液来源的白细胞在形态上存在差异，乳汁来源的白细胞细胞质与细胞核比例增加，质膜外观模糊，且乳汁来源的中性粒细胞中存在细胞质空泡。
2. 健康乳腺腺区中性粒细胞上 MHC II 类分子和 CD25 的高表达：通过流式细胞术分析表面受体 CD11b、CD62L、MHC II 类分子和 CD25 的表达，发现健康乳腺腺区乳汁来源的中性粒细胞上 MHC II 类分子表达水平高，而血液来源和发炎腺区的中性粒细胞上该分子表达显著降低。类似地，健康乳腺腺区中性粒细胞表面 CD25 表达高，与血液来源的中性粒细胞相比有显著差异，但与发炎腺区的中性粒细胞相比无显著变化。这些差异表明健康乳腺腺区乳汁来源的中性粒细胞可能具有更强的抗原呈递和激活能力。
3. 乳汁来源细胞中 ROS 生成减少及凋亡率增加：使用 Annexin V/PI 染色检测细胞凋亡，发现发炎乳腺腺区的中性粒细胞早期凋亡率（Annexin V⁺/PI^?）显著高于血液来源的中性粒细胞。健康和发炎乳腺腺区乳汁来源的中性粒细胞晚期凋亡率（Annexin V⁺/PI⁺）均显著高于血液来源的中性粒细胞，且健康乳腺腺区乳汁来源的中性粒细胞晚期凋亡率更高。用佛波醇 12 - 肉豆蔻酸 13 - 乙酸酯（PMA）刺激细胞后，检测活性氧（ROS）生成，发现健康和发炎乳腺腺区的中性粒细胞 ROS 生成显著低于血液来源的中性粒细胞。此外，乳汁来源细胞在 PMA 刺激后的氧消耗率（OCR）也显著低于血液来源细胞，且 ROS 生成减少和 OCR 降低与细胞凋亡率增加相关。
4. 血液和乳汁来源白细胞线粒体功能改变：通过 Seahorse XF 细胞线粒体应激试验分析线粒体功能，发现健康和发炎乳腺腺区乳汁来源的白细胞与血液来源的细胞相比，ATP 相关呼吸显著降低，备用呼吸能力也显著下降，且发炎腺区乳汁来源的白细胞备用呼吸能力比健康腺区更低。这表明乳汁来源的细胞可能存在能量应激，对能量需求变化的适应能力降低。

研究结论和讨论部分指出，该研究发现了血液、健康乳腺腺区乳汁和发炎乳腺腺区乳汁中存活白细胞亚群的不同组成。MHC II 类分子和 CD25 在健康乳腺腺区中性粒细胞上的高表达，提示这些细胞可能具有免疫调节特性。尽管乳汁来源的中性粒细胞 CD25 表达增加，但 ROS 生成减少，可能是由于乳汁中白细胞介素 - 2（IL - 2）水平不足或其他因素。此外，研究还发现细胞凋亡率与乳腺腺区健康状况相关，健康乳腺腺区中性粒细胞的高晚期凋亡率表明其凋亡调节可能不受邻近炎症的影响，体现了乳腺腺区的免疫独立性。而乳汁来源细胞线粒体功能的改变，如 ATP 生成减少和备用呼吸能力降低，可能是由炎症过程中的多种因素导致，包括促炎细胞因子和氧化应激，这也暗示了乳腺腺区间可能存在免疫依赖性。总之，该研究揭示了乳汁来源中性粒细胞与外周血来源中性粒细胞在免疫功能和代谢表型上的显著差异，为进一步研究乳腺炎症的发病机制和治疗策略提供了重要依据。