大肠杆菌 AZY 操纵子：连接铜摄取与抗生素耐药性的关键纽带

《Communications Biology》：The Escherichia coli AZY operon links copper uptake to antibiotic resistance

为探究铜摄取与抗生素耐药性的关联，研究人员聚焦大肠杆菌 AZY 操纵子，发现其介导铜摄取并影响 mar 通路，为抗菌研究提供新方向。

　　在微观的细菌世界里，铜元素扮演着十分重要的角色。它是生命活动中不可或缺的金属离子，在生化过程中通过在Cu+和Cu2+两种状态间转换，推动氧化还原反应，对所有生物的生存都至关重要。然而，“成也萧何，败也萧何”，过量的铜却如同细菌体内的 “定时炸弹”，会引发氧化损伤，干扰铁硫簇的正常功能，破坏信号传导通路，甚至导致细胞死亡，即铜中毒（cuprotosis）。因此，维持铜离子的稳态平衡，对于细菌来说就像走钢丝一样，需要小心翼翼。

在真核生物中，铜离子的转运和分布机制已经被研究得较为透彻。但在原核生物领域，情况却大不相同。尽管革兰氏阳性菌的铜酶能够直接从环境中获取铜，但革兰氏阴性菌的铜摄取机制却迷雾重重。由于细菌的铜酶大多位于细胞周质和内膜，对于铜离子究竟如何进入革兰氏阴性菌的细胞质，科学界一直缺乏深入的了解。此外，在抗生素耐药性方面，多重耐药（mar）操纵子可被铜信号激活，从而使细菌产生抗生素耐药性，然而铜信号的来源却始终是个未解之谜。这些问题如同一个个谜团，吸引着科研人员去探索和解答。

为了揭开这些谜团，来自美国西北大学（Northwestern University）分子生物科学系和化学系以及以色列理工学院（The Technion - Israel Institute of Technology）医学院生物化学系和拉帕波特医学科学研究所的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦在大肠杆菌的 AZY 操纵子上，经过一系列的实验和分析，取得了重要的研究成果。相关研究成果发表在《Communications Biology》上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。在基因编辑方面，他们采用了 Datsenko 等人的方法构建了缺失整个 yobA - yebZ - yebY 操纵子的 ΔAZY 菌株；通过定点突变技术，对 YebZ 蛋白进行改造，探究特定氨基酸残基的作用。在检测分析方面，利用报告基因法，将 luxCDABE 基因与 copA 启动子或 mar 操纵子的 5’UTR 调控区融合，通过检测荧光素酶活性来监测铜离子摄取和 mar 操纵子的激活情况；借助电感耦合等离子体质谱（ICP - MS）精确测定细胞内的金属含量；运用 AlphaFold Multimer 进行蛋白质结构建模，预测 YebZ 和 YobA 的结构及相互作用；还通过生物信息学分析，对大量细菌基因组中的 CopD 家族序列进行研究，探究其分布和进化关系。

研究结果如下：

1. AZY 蛋白调节大肠杆菌内铜水平：研究人员首先比较了野生型（WT）和 ΔAZY 菌株在铜摄取方面的差异。通过将含有 luxCDABE 基因的质粒 pcopA - Lux 分别转入这两种菌株，以监测细胞内铜水平的变化。实验结果显示，在添加CuSO4?后，WT 菌株的荧光强度迅速上升，且比 ΔAZY 菌株高 3 - 4 倍，这表明 YobA、YebZ 和 YebY 参与了铜的调节途径，并且可能协同发挥作用。进一步的研究发现，YebZ 单独过表达能显著提高细胞内铜含量，且对铜具有特异性摄取能力，这一过程是能量依赖的。而 YobA 与 YebZ 共同过表达时，细胞内铜含量进一步增加，说明 YobA 在铜转运中起到关键作用；相反，YebY 与 YebZ 共表达会减少细胞内积累的铜，暗示 YebY 可能对铜摄取起负调控作用。通过构建 YebZ 的结构模型，研究人员发现两个高度保守的组氨酸残基 His135 和 His154，将它们分别突变为丙氨酸后，铜摄取能力显著下降甚至完全丧失，证明这两个残基对铜的摄取至关重要。
2. AZY 蛋白在 mar 介导的抗生素耐药性中起作用：研究人员利用报告基因法，将 luxCDABE 基因融合到 mar 操纵子的 5’UTR 调控区，构建了质粒 pmarO - Lux。实验结果表明，在有或没有水杨酸（mar 通路的诱导剂）存在的情况下，ΔAZY 菌株的荧光强度均下降了 80 - 90%，这意味着 AZY 蛋白对于 mar 操纵子的激活是必不可少的。在抗生素抗性实验中，研究人员发现，ΔAZY 菌株对四环素和氯霉素的敏感性与 WT 菌株相同，因为这两种抗生素的抗性与 mar 通路无关。但对于诺氟沙星、环丙沙星和氨苄青霉素，ΔAZY 菌株则表现出更高的敏感性，在接触这些抗生素后，细菌迅速死亡裂解，光密度急剧下降，这表明 AZY 操纵子特异性地参与了 mar 通路介导的多药耐药性。
3. AZY 蛋白将铜摄取与多药耐药性联系起来：为了验证 AZY 操纵子在连接细胞内铜传递和抗生素耐药性方面的关键作用，研究人员用铜螯合剂三乙四胺（TETA）去除缓冲液和生长培养基中的残留铜。结果发现，铜的去除显著降低了 WT 菌株中 mar 操纵子的活性，使其对诺氟沙星的敏感性增加了约 3 倍，而对 ΔAZY 菌株几乎没有影响。这一结果有力地证明了由 AZY 系统导入的铜参与了 mar 调控和抗生素耐药性过程。
4. 铜摄取用于抗生素耐药性可能是细菌中的保守机制：研究人员对约 50,000 个 CopD 家族序列进行了生物信息学分析，发现大多数 CopD 家族成员存在于 γ - 变形菌纲（Gammaproteobacteria）中，主要属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。约 50% 的序列有 8 个预测的跨膜螺旋（TMHs），且包含与 YebZ 功能相关的两个高度保守的组氨酸残基。通过对 CopD 编码基因的基因组邻域分析，发现大多数 copD 基因靠近 copC，且许多与铜稳态相关的基因也位于附近，包括编码铜抗性蛋白、铜转运蛋白和 DUF 蛋白的基因。这表明铜摄取通过 AZY 蛋白调节抗生素耐药性的机制可能在多种细菌中广泛存在，包括致病菌。

综合上述研究，研究人员证实了大肠杆菌的 AZY 操纵子是一个广泛存在的铜特异性摄取系统，它通过为 mar 通路的激活提供铜，在调节多药耐药性方面发挥着关键作用。这一发现更新了人们对铜离子进入细菌细胞质机制的认识，也揭示了铜离子在细菌抗生素耐药性中的重要作用。这不仅为理解细菌的生理过程提供了新的视角，更为未来对抗多药耐药性的研究提供了潜在的治疗靶点，有望推动抗菌药物研发领域的新突破，在生命科学和医学领域具有重要的意义。