人类甲状腺激素转运蛋白 MCT10 的结构与功能研究：解锁关键生理机制与疾病关联密码

本文通过解析人甲状腺激素转运蛋白 MCT10 的冷冻电镜结构，揭示其功能机制，为相关疾病治疗提供新思路。

　　

引言

单羧酸转运蛋白（MCT）家族隶属于溶质载体家族 16（SLC16），在人体生理和病理过程中意义重大。该家族成员能介导单羧酸（如 L - 乳酸、丙酮酸和酮体）的质子偶联跨膜运输，参与细胞内和细胞间的乳酸穿梭，调节细胞内 pH 值，像 MCT1 在 Cori 循环中就发挥着关键作用。而且，多数癌症依赖糖酵解和乳酸发酵供能，MCT 介导的乳酸穿梭促进了肿瘤的生长和增殖，使得 MCT 成为治疗代谢紊乱和癌症的潜在靶点。

MCT 家族包含 14 种人类蛋白，MCT8 和 MCT10 是其中的重要成员，二者具有独特的货物特异性，能运输甲状腺激素。甲状腺激素对人体正常发育不可或缺，影响众多细胞功能。MCT8 在甲状腺激素转运中作用明确，尤其在神经元细胞运输和血脑屏障转运方面，MCT10 可能起到辅助作用。此外，MCT10 还能运输芳香族氨基酸，对甲状腺激素合成和其运输底物的体内平衡意义非凡。MCT8 功能异常会引发严重的 Allan-Herndon-Dudley 综合征，MCT10 功能缺失则可能与蓝尿布综合征以及非酒精性脂肪性肝炎相关。

尽管 MCT 在生理和病理过程中至关重要，但目前对其分子层面的理解较为有限。例如，MCT 的运输机制存在争议，尚不清楚其是作为被动单向转运体还是质子协同转运体发挥作用，而且不同 MCT 成员在货物范围、亲和力和动力学等方面存在差异，其正确定位和功能发挥可能还依赖于糖基化伴侣。当前，MCT 的结构信息也较为匮乏，已有的结构研究仅涉及部分细菌和人类 MCT 的特定构象。因此，深入探究 MCT 的结构和功能，对于理解其在生理和病理过程中的作用以及开发相关疾病的治疗方法至关重要。

结果

1. 蛋白质分离和冷冻电镜数据收集：为深入研究人 MCT10（UniProt ID：Q8TF71）的结构和功能，研究人员利用 PAP1500 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株过量表达该蛋白。构建的蛋白包含酵母密码子优化的全长野生型序列，以及烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点、绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和十聚组氨酸标签。通过一系列复杂的纯化步骤，包括使用去污剂提取和多种色谱技术，最终获得了相对均匀和纯净的样品。随后，将蛋白冷冻在网格上，利用先进的仪器收集冷冻电镜数据，并通过标准的数据处理流程，最终获得了分辨率为 3.5 ? 的 MCT10 结构。该结构显示，MCT10 在研究条件下呈单体构型，12 个跨膜螺旋清晰可辨，为后续的模型构建和分析奠定了坚实基础。
2. 主要促进因子超家族折叠的向内开放结构：MCT10 的整体结构呈现出经典的主要促进因子超家族（MFS）折叠，与其他已研究的 MCTs 结构相似。其独特之处在于，在 M6 和 M7 之间的长胞质环的 C 末端发现了一个额外的 9 个氨基酸长的螺旋（I282 - V290），该螺旋位于膜界面，具有稳定结构的作用。MCT10 结构中最显著的特征是一个从细胞质侧延伸的深 cleft，它将蛋白分为 N 端和 C 端两个亚结构域，且该 cleft 延伸至膜的中部，形成一个较大的腔室，与已知的运输底物和配体结合位点重叠，表明 MCT10 的结构为向内开放状态，这一结论得到了与其他 MCT1 结构对比的支持。
3. 暴露于保守和重要残基的货物结合口袋：虽然在预期的货物结合位点未检测到苯丙氨酸（Phe）的密度，但研究人员推测其可能与货物在运输过程中或低占有率、高灵活性有关。MCT10 的结合口袋周围有多个重要残基，如 N81、F85、N89 等，这些残基在 MCT10 和 MCT8 中部分保守，且与货物结合和运输功能密切相关。例如，突变 MCT8 中与 MCT10 中 F85、R343 和 D396 等效的残基会导致活性丧失，这充分证明了这些残基的重要性。此外，N81 和 Y184 分别对 MCT10 运输色氨酸和苯丙氨酸至关重要，尽管它们对 T3 运输的影响尚不清楚，但也暗示了这些残基在货物特异性识别中的潜在作用。
4. 与化学性质相符的货物结合模型：在缺乏实验结构数据支持货物与 MCT10 结合方式的情况下，研究人员通过分子对接研究 T3 和 Phe 与 MCT10 的结合模式。利用 DiffDock v1.1.2 和 Gnina v1.1 软件进行对接和能量最小化，结果显示 Phe 和 T3 的预测结合模式有良好的重叠。结合模型表明，货物的氨基和羧基分别与特定残基形成氢键和盐桥，疏水性部分则被疏水残基包围，这种结合方式与化学性质相符，且得到了 AlphaFold3 预测模型的支持。同时，T3 的结合模式与已知的甲状腺激素受体结合模式相似，进一步验证了模型的合理性。
5. 疾病数据和功能表征验证了货物结合模型：MCT8 的致病错义突变与 MCT10 的结合口袋结构高度相关，通过对 MCT10 结构的分析，可以直观地了解这些突变对货物结合的影响。例如，H118R 和 R371C 突变直接影响了与 MCT10 中 Q88 和 R343 等效的残基，进而影响货物结合。通过非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞进行放射性 Phe 摄取实验，结果表明 F85 和 D396 等突变对 MCT10 的活性有显著影响，这进一步验证了货物结合模型的准确性，表明这些残基在货物结合和运输中起着关键作用。

讨论

1. MCT8 和 MCT10 的差异：尽管 MCT10 和 MCT8 在货物运输特异性上存在差异，MCT10 主要运输 T3 和某些芳香族氨基酸，而 MCT8 主要运输 T3 和 T4，但目前的研究数据尚无法完全解释这种选择性差异。二者结合口袋区域的主要差异在于 Q88（MCT10）和 H118（MCT8）的不同，以及 S121、T214 等残基的差异。研究发现，S121 的改变会影响 MCT10 的运输能力，使其更接近 MCT8，这表明 S121 - Q88 - N89 - T214 网络以及 Y184/T207/L304 等残基可能通过影响货物的摄取、结合和释放来调节货物特异性。
2. 向外开放的 AlphaFold3 模型和两个束的刚体运动：利用 AlphaFold3 构建的 MCT10 向外开放模型显示，其与向内开放结构呈现镜像对称，且两个跨膜螺旋束在构象变化中主要作为刚体移动，这与二级转运体的摇杆开关机制相符。通过对向内开放结构和向外开放模型中每个跨膜螺旋相对位置的分析，发现构象变化时束内变化较小，进一步支持了这一结论。此外，货物在向内开放和向外开放状态下的结合模式相似，暗示货物结合亲和力在膜两侧可能相似，这与 MCT8 和 MCT10 作为被动转运体的分类一致。
3. 向内开放和向外开放状态结合口袋的微小差异：分析 AlphaFold3 预测的向内开放和向外开放状态下货物的结合模式发现，二者在整体上相似，但 N 端束的一些残基如 N81、Q88、N89、S121 和 T214 在两个状态下存在较大位移。这些差异表明，结合口袋在两个状态下相对稳定，尤其是 C 端束，但 N 端束的变化可能影响货物的结合和释放过程。表面可及性分析显示，T3 在向外开放模型的结合口袋中也能很好地容纳，这进一步支持了货物结合亲和力在膜两侧相似的观点，同时也表明 MCT10 可能根据货物的可用性来决定运输方向。
4. MCT2 中跨膜段 M5 的位移：MCT2 的向内开放结构与 MCT1 和 MCT10 存在差异，主要体现在 M5 的位置上。MCT2 中 M5 向 cleft 方向移动，导致细胞质表面可及性降低。这种差异可能使 MCT2 的构象在货物运输过程中处于不同阶段，或者 MCT2 需要较窄的 cleft 来实现货物运输，这可能与 MCT2 的二聚体组装有关，因为较宽的向内开放构象可能与二聚体设置不兼容，或者需要动态重组单体 - 单体界面。
5. M1 - kink 对特异性和运输机制的可能意义：M1 - kink 区域的 Q88、N81、N89 和 S121 等残基在向内开放结构和向外开放 AlphaFold3 模型之间存在较大位移。这些残基可能作为潜在的触发因素，在货物结合或释放时引发构象变化。N89 在不同状态下与不同残基相互作用，S121A 替换会改变 MCT10 的运输特异性，这表明该区域可能通过调节 M1 - kink 的形状来间接影响货物特异性，并且可能作为货物存在的传感器，在货物结合或释放时引发 N 端束的重塑，从而实现向内开放和向外开放构象之间的转换。
6. 结论：本研究成功解析了人 MCT10 的实验结构，该结构处于向内开放状态，揭示了其与货物结合的口袋结构，并且通过结合模型、疾病数据和功能表征等多方面的研究，深入探讨了 MCT10 的结构与功能关系。研究发现，MCT10 的两个 MFS 束在运输过程中主要作为刚性体移动，结合口袋相对稳定，货物结合亲和力在膜两侧可能相似，这为理解 MCT 的运输机制提供了重要依据。此外，研究还发现货物特异性和传感可能与 M1 - kink 相关，这为进一步研究 MCT 的功能提供了新的方向。这些研究成果对于开发针对 MCT 相关疾病的治疗方法具有重要的指导意义，有望为药物设计提供新的靶点和思路。}