绵羊乳腺类器官的构建及其在泌乳与乳腺炎研究中的关键突破

《BMC Veterinary Research》：Establishment and characterization study of ovine mammary organoids

为解决绵羊泌乳和乳腺炎研究缺乏合适体外模型的问题，研究人员开展绵羊乳腺类器官（MaOs）研究，成功建立相关培养体系，为后续研究提供重要工具。

　　在动物科学领域，绵羊奶有着独特的价值，其蛋白质和脂肪含量高于牛奶和羊奶，还富含多种对人体有益的生物活性物质，如脂肪酸、钙、磷、铁、镁以及具有抗菌、免疫调节和抗氧化功能的成分 。然而，由于缺乏合适的体外模型，对绵羊泌乳调节机制的探索研究一直受到限制。以往的体外研究多依赖细胞系，但单层细胞培养无法模拟体内复杂的组织架构和细胞间相互作用，比如乳腺腔上皮细胞在体外培养时会失去与微环境的相互作用，进而导致表型和形态改变，甚至极性丧失。类器官（organoid）技术的出现为解决这一难题带来了希望，它通过三维培养模型，能够重现原代组织的细胞异质性、结构和功能。目前，小鼠和人类的乳腺类器官研究较为广泛，牛、猪、犬和马的乳腺类器官培养体系也已建立，但绵羊乳腺类器官（MaOs）的培养体系却一直缺失，这严重阻碍了对绵羊泌乳性状机制的探索和乳腺炎的研究。

为了填补这一空白，内蒙古大学等研究机构的研究人员开展了深入研究。他们的研究成果发表在《BMC Veterinary Research》上，成功建立了绵羊乳腺类器官的分离、培养、鉴定和基因操作的实验方案，为研究绵羊泌乳和乳腺炎的调节机制提供了重要的生理相关模型。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是组织样本的处理与类器官的获取，他们从当地屠宰场采集处于泌乳中期的小尾寒羊乳腺组织，经过一系列清洗、消毒和处理后，利用不同的酶消化法分离乳腺类器官。其次，采用多种检测技术对类器官进行分析，如利用定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测基因表达水平，通过免疫荧光技术鉴定细胞类型，使用特定试剂盒测定上清液中甘油三酯（TG）、乳糖和酪蛋白 2（CSN2）的浓度，还运用电穿孔技术进行类器官的转染实验。

在绵羊 MaOs 的分离结果方面，研究人员对比了不同的酶消化方法。结果显示，与使用 II 型胶原酶和透明质酸酶的混合酶溶液（Digestion B）相比，采用 IV 型胶原酶（Digestion A）消化 60 分钟能分离出更多的乳腺类器官。虽然在培养第 3 天，两种消化方法的类器官形成效率没有显著差异，均在 76 - 81% 之间，但 Digestion A 在获取类器官数量上更具优势。

关于绵羊 MaOs 的培养优化，研究发现随着培养时间增加，MaOs 的形态会发生变化。在三种培养基（A、B、C）中，培养基 B 表现出更好的培养效果。在培养前期（D3 和 D7），三种培养基中的 MaOs 都呈现出囊腔结构，但到了 D14 和 D21，培养基 C 中的部分 MaOs 边界不明显，呈实心球体且有粘连现象，而培养基 A 和 B 中的 MaOs 生长状态更好，培养基 B 在 D7 时还出现了生理出芽结构。从生长曲线来看，三种培养基中 MaOs 的增殖趋势相似，前期较慢，D7 后加快，D14 达到平台期，培养基 B 中的 MaOs 密度更高。EdU 染色结果表明，培养基 B 中增殖细胞的比例（44.60 ± 1.85%）极显著高于培养基 A（25.77 ± 0.90%）和 C（13.67 ± 1.25%）。

在细胞类型和泌乳功能鉴定方面，通过 RT-PCR 分析细胞角蛋白 14（CK14，肌上皮细胞标记物）、CK18 和 CK7（腔上皮细胞标记物）的表达，证实了培养的 MaOs 中同时存在腔上皮细胞和肌上皮细胞，免疫荧光染色进一步验证了这一结果，且 CK18⁺细胞位于内侧，CK14⁺细胞位于外侧。对牛奶脂质代谢相关基因（XDH、FABP3、SREBP1）、乳糖代谢相关基因（GLUT1、GLUT4）和牛奶蛋白合成基因（EIF4E、CSN2）的 qRT-PCR 分析显示，培养基 B 中这些基因的表达在多个时间点均显著高于其他两种培养基。在 D7 时，培养基 B 中 MaOs 分泌到上清液中的 TG、乳糖和 CSN2 浓度也显著高于培养基 A 和 C。同时，研究发现培养基 B 中 MaOs 的牛奶合成相关基因表达在 D7 达到最高，之后下降，但均低于乳腺组织。

在绵羊 MaOs 的转染实验中，研究人员探索了不同电穿孔电压（100V、150V、200V）对转染效率的影响。结果表明，只有 200V 组出现了绿色荧光蛋白（GFP）阳性的 MaOs，转染效率约为 27.3%。

综合来看，该研究成功建立了绵羊乳腺类器官的培养体系，所培养的 MaOs 包含腔上皮细胞和肌上皮细胞，并具有泌乳功能，电穿孔技术可有效用于绵羊 MaOs 的转染。这一成果为研究绵羊泌乳性状的调控机制和乳腺炎的发病机制提供了新的工具，有助于推动兽医和农业科学领域的相关研究。后续还需对培养的 MaOs 进行转录组分析，以更全面地评估其基因表达模式，同时绵羊乳腺干细胞来源的 MaOs 培养体系也有待进一步研究完善。