CRISPR 靶向 ARPE-19 细胞中与年龄相关性黄斑变性相关 SNP：操控补体系统的潜在模型

研究人员针对年龄相关性黄斑变性（AMD），用 CRISPR 技术在 ARPE-19 细胞中靶向相关 SNP，实现补体系统操控，为治疗提供新方向。

　　年龄相关性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration，AMD）是一种在发达国家导致不可逆中心视力丧失的主要疾病，全球约 8.7% 的失明由其引起，预计未来 25 年将有 2.55 亿人受影响。AMD 的关键特征是视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）和 Bruch 膜之间出现玻璃膜疣。其发病机制涉及慢性炎症过程，补体系统在其中发挥重要作用。许多与 AMD 相关的遗传变异（单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）存在于补体基因中，然而，目前对于通过靶向这些 SNP 来调控补体系统的研究尚不完善，且缺乏合适的体外模型来评估相关治疗方案。

为了解决这些问题，英国牛津大学 Nuffield 临床神经科学系等机构的研究人员开展了一项研究，旨在探索利用 CRISPR 技术靶向与 AMD 相关的 SNPs，操控补体系统，为 AMD 的治疗提供新的方向和潜在策略。该研究成果发表在《Gene Therapy》杂志上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，培养和分化 ARPE-19 细胞，这是一种来源于 19 岁男性原发性 RPE 培养的人永生化细胞系，具有稳定的单层生长和 RPE 特征，适合作为 AMD 研究的模型。其次，设计并克隆针对特定 SNPs 的引导 RNA（guide RNA，gRNA），构建相关载体。然后，通过慢病毒转导将构建好的载体导入 ARPE-19 细胞。最后，利用追踪插入缺失分解（Tracking by Indels Decomposition，TIDE）分析和下一代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）等技术，评估靶向效率和等位基因特异性。

研究结果如下：

1. 细胞特征及 SNP 筛查：分化的 ARPE-19 细胞呈现出预期的鹅卵石上皮形态和紧密的单层结构，通过核型分析证实其为二倍体，虽存在少量染色体易位，但不影响实验。经 PCR 基因分型，在 ARPE-19 细胞的补体因子基因中鉴定出 21 种不同的 SNPs，为后续研究提供了基础。
2. 靶向效率分析：将携带 gRNA 的慢病毒转导至 ARPE-19 细胞，TIDE 分析显示编辑率最高可达 36%。编辑效率因 gRNA 靶向的 SNP 不同以及 PAM（原间隔相邻基序）相对位置而异。例如，CFH 的 SNP rs1410996 和 rs1061170 的编辑效率分别为 33.8% 和 35.5%；CFB 的 SNP rs4541862 编辑效率在 3% - 36.7% 之间，rs641153 在 3.4% - 23.8% 之间。
3. 等位基因特异性评估：NGS 分析表明，在靶向不同 SNP 时，靠近 PAM 位点的 SNP 能实现近乎完全的等位基因特异性编辑，编辑主要发生在目标等位基因上。如靶向 CFH 风险变异 rs1410996 的致病形式时，致病等位基因的编辑率为 19.05%，而野生型等位基因仅为 1.3%。然而，当 SNP 距离 PAM 位点较远时，等位基因特异性会降低，如 Rv-gRNA1 靶向 CFB 保护变异 rs641153 时，编辑率和等位基因特异性均较低。
4. 等位基因比例变化：靶向正常 SNP 会使致病 SNP 的比例增加，而靶向致病 SNP 则会使正常 SNP 的比例增加。例如，针对 rs541862，靶向正常（T）SNP 会使该等位基因比例下降，致病（C）等位基因比例上升；靶向致病（C）等位基因时，正常（T）等位基因比例会上升。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功利用 CRISPR 技术在 ARPE-19 细胞中对与 AMD 相关的 SNPs 进行了高效编辑，并实现了一定程度的等位基因特异性。这为操控 AMD 模型中的补体系统提供了理论依据和技术支持，为未来 AMD 的治疗和预防奠定了基础。尽管目前尚不清楚编辑补体系统中 AMD 相关变异的生理影响，但从分子层面证明了这种操控的可行性。不过，该研究也存在一定局限性，如部分 gRNA 的特异性欠佳，对于位于合适种子区域外的 SNP 靶向效率较低，且存在较高的非预期插入缺失突变率。未来需要进一步开展功能研究，深入理解补体系统在 AMD 中的作用，同时探索更有效的基因编辑策略，以提高治疗效果。