利用 RPA/CRISPR-Cas12a 与侧向流动分析法快速诊断向日葵茎溃疡病菌

　　向日葵，作为世界主要油料作物之一，不仅在食用油生产方面占据重要地位，还广泛应用于医药、化妆品领域，甚至非油用向日葵还具有观赏价值，其种子也是深受欢迎的零食以及鸟类和小宠物的食物。然而，一种名为向日葵茎溃疡病菌（Diaporthe helianthi，简称 D. helianthi）的真菌，正严重威胁着向日葵的生长。它能感染向日葵的叶片、茎和花序，在发病初期，茎与叶柄连接处会出现灰褐色斑点，随后斑点迅速蔓延，环绕茎部，导致茎上部枯萎坏死、叶片萎蔫、花盘发育不良以及种子无法成熟。自 1980 年在南斯拉夫首次被发现后，它迅速传播到法国、美国、意大利等多个国家，给向日葵的产量带来了极大损失，例如 1984 年法国的向日葵因该病减产 40%。

在植物病害防治中，早期准确检测病原菌至关重要。传统的植物真菌病原菌鉴定方法，如形态学鉴定、分离培养后观察形态和测序等，不仅耗时费力，还需要昂贵的设备和专业技术人员操作，难以在实验室外的现场进行检测。目前已有的核酸检测方法，像基于聚合酶链反应（PCR）及其相关技术，虽然在一定程度上提高了检测效率，但仍存在局限性，例如实时荧光定量 PCR（TaqMan real-time PCR）需要较高温度和热循环条件，限制了其在野外和港口现场检测的应用。因此，开发一种快速、灵敏且便于现场操作的检测方法迫在眉睫。

中国检验检疫科学研究院等机构的研究人员针对这一问题展开研究。他们成功开发了一种基于重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）结合 CRISPR-Cas12a 的快速检测体系，并将其与侧向流动分析技术相结合，相关研究成果发表在《Phytopathology Research》上。

研究人员在此次研究中用到了多个关键技术方法。首先是 RPA 技术，这是一种等温核酸扩增技术，能在 37 - 42°C 恒温条件下，仅用一对引物就快速指数式扩增 DNA。其次是 CRISPR-Cas12a 技术，CRISPR-Cas12a 是一种 RNA 引导的核酸内切酶，在 CRISPR RNA（crRNA）的引导下，识别富含 T 的原间隔相邻基序（Protospacer-Adjacent Motif，PAM，TTTN）序列，并具有附带切割活性。利用这一特性，研究人员构建了基于 CRISPR-Cas12a 的荧光检测和侧向流动检测平台。同时，研究人员从感染 D. helianthi 的植物组织或病菌菌丝体中提取 DNA，用于后续检测分析。

在研究结果方面：

1. RPA/CRISPR-Cas12a 检测策略：先提取 D. helianthi 的基因组 DNA 或感染植物组织的总 DNA，然后用 RPA 基础扩增试剂盒在 37°C 扩增 25 分钟，最后用 CRISPR-Cas12a 荧光检测或侧向流动分析法检测 RPA 产物。当存在阳性 RPA 产物时，Cas12a/crRNA 复合物会结合目标核酸，激活附带切割活性，切割带有荧光基团或生物素的单链 DNA（ssDNA）报告分子，从而产生荧光信号或在侧向流动试纸条上形成检测线。
2. RPA 引物筛选：研究人员设计了四对引物，通过 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析 RPA 产物，发现引物 Dh-Cal-F1/Dh-Cal-R1 能特异性扩增 D. helianthi 基因组 DNA，灵敏度最佳，可检测低至 200 pg 的 D. helianthi 基因组 DNA，因此选择该引物进行后续实验，并根据 RPA 产物设计了 crRNA。
3. RPA/CRISPR-Cas12a 检测优化：通过对 RPA 扩增时间、FQ 报告分子浓度、CRISPR-Cas12a 反应时间和 LF 报告分子浓度等条件进行优化，确定了最佳实验条件。如 RPA 扩增 25 分钟、FQ 报告分子浓度为 0.2 μmol/L、CRISPR-Cas12a 反应 20 分钟、LF 报告分子浓度为 0.2 μmol/L。
4. 特异性：在优化条件下，对 D. helianthi 和其他病原菌的 DNA 样本进行检测。荧光检测结果显示，只有 D. helianthi 基因组 DNA 产生明显荧光强度；侧向流动试纸条检测也仅 D. helianthi 的 DNA 样本出现明显检测线，表明该检测方法能准确区分 D. helianthi 与其他真菌。
5. 灵敏度：用开发的 RPA/CRISPR-Cas12a 方法检测十倍系列稀释的 D. helianthi 基因组 DNA，结果显示荧光检测法可检测低至 0.1 pg/μL（1.4 copies/μL）的基因组 DNA，侧向流动试纸条法可检测 1 pg/μL（14 copies/μL）的基因组 DNA，而传统实时荧光定量 PCR 只能检测到 10 pg/μL（1.4×102 copies/μL）的基因组 DNA，说明新方法灵敏度约为实时荧光定量 PCR 的 100 倍。
6. 植物样本适用性：研究人员将 D. helianthi 菌丝体粉末添加到健康向日葵的叶片、茎和种皮等组织中，提取 DNA 后用 RPA/CRISPR-Cas12a 检测。结果表明，荧光检测和侧向流动试纸条法都能检测到混合在植物组织中的 D. helianthi 菌丝体。同时，对接种 D. helianthi 孢子的向日葵幼苗进行检测，发现 RPA/CRISPR-Cas12a 荧光检测法在接种后 5 天就能检测到病原菌，而侧向流动试纸条法和实时荧光定量 PCR 在接种后 10 天才能检测到。

研究结论和讨论部分指出，该研究开发的基于 RPA/CRISPR-Cas12a 的检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高和可视化等优点。灵活的信号读取模式，包括侧向流动试纸条和荧光信号读取，结合便携式恒温金属孵育器，能很好地满足现场检测的便携性要求。与之前报道的实时荧光定量 PCR 方法相比，该方法灵敏度更高或相当，且反应时间短、效率高、操作简单。结合快速核酸提取技术，能够实现对田间样本中病原菌的快速检测，为港口检疫和早期现场诊断提供了一种新技术。此外，研究还发现以钙调蛋白（Cal）基因为靶点的引物在检测 D. helianthi 时灵敏度最高，表明 Cal 基因在 D. helianthi 基因组 DNA 中可能具有更多拷贝数和保守位点。同时，研究人员建议在实际检测中，由于茎是 D. helianthi 的主要感染部位且检测干扰最小，可将茎作为最佳采样对象。这项研究成果对于防控向日葵茎溃疡病菌的传播、保障向日葵产业的健康发展具有重要意义 。<【利用 RPA/CRISPR-Cas12a 与侧向流动分析法快速诊断向日葵茎溃疡病菌】【为解决向日葵茎溃疡病菌（Diaporthe helianthi）检测难题，研究人员开发 RPA/CRISPR-Cas12a 检测体系，灵敏度高且适用于现场检测。】【向日葵 | 茎溃疡病菌 | 重组酶聚合酶扩增（RPA）|CRISPR-Cas12a | 侧向流动分析 | 病原菌检测 | 植物检疫 | 核酸检测 | 真菌病害 | 快速诊断】【国内】【在广袤的田野中，向日葵总是以其灿烂的花盘和挺拔的身姿吸引着众人目光。它不仅是重要的油料作物，还在多个领域发挥着关键作用。然而，一种名为向日葵茎溃疡病菌（Diaporthe helianthi，简称 D. helianthi）的 “隐藏杀手”，正悄然威胁着向日葵的生长，让种植户们忧心忡忡。

D. helianthi 就像一个狡猾的 “破坏者”，它主要侵袭向日葵的叶片、茎和花序。发病初期，茎与叶柄连接处会出现灰褐色斑点，这些斑点就像一个个 “小恶魔”，迅速蔓延，环绕茎部。不久后，茎上部开始枯萎坏死，叶片变得无精打采地萎蔫，花盘发育不良，种子也无法正常成熟。自 1980 年在南斯拉夫首次现身，它便开始了 “侵略之旅”，传播到法国、美国、意大利等国家，给当地的向日葵种植带来了沉重打击，1984 年法国的向日葵因它减产 40%，让种植户们损失惨重。

在植物病害防治这场 “战斗” 中，早期准确检测病原菌是关键的 “武器”。但传统的植物真菌病原菌鉴定方法，就像老旧的 “武器装备”，存在诸多不足。比如形态学鉴定，要经过分离培养、观察形态、测序等繁琐步骤，不仅耗时费力，还需要昂贵的设备和专业技术人员操作，难以在实验室外的现场发挥作用。目前已有的核酸检测方法，像实时荧光定量 PCR（TaqMan real-time PCR），虽然有一定进步，但它需要较高温度和热循环条件，就像被限制在特定 “战场” 的武器，在野外和港口现场检测时受到很大限制。所以，开发一种快速、灵敏且便于现场操作的检测方法，成为了科研人员亟待攻克的难题。

中国检验检疫科学研究院等机构的研究人员勇挑重担，针对这一问题展开研究。他们成功开发了一种基于重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）结合 CRISPR-Cas12a 的快速检测体系，并将其与侧向流动分析技术相结合，相关研究成果发表在《Phytopathology Research》上。

在研究过程中，研究人员使用了几种关键技术方法。RPA 技术就像一个高效的 “复制器”，它能在 37 - 42°C 的恒温条件下，仅用一对引物就快速指数式扩增 DNA。CRISPR-Cas12a 技术则像一个精准的 “分子剪刀”，在 CRISPR RNA（crRNA）引导下，识别特定序列并切割目标核酸。利用这些特性，研究人员构建了基于 CRISPR-Cas12a 的荧光检测和侧向流动检测平台。同时，研究人员从感染 D. helianthi 的植物组织或病菌菌丝体中提取 DNA，为后续检测分析做准备。

研究结果令人振奋：

1. RPA/CRISPR-Cas12a 检测策略：首先提取 D. helianthi 的基因组 DNA 或感染植物组织的总 DNA，接着用 RPA 基础扩增试剂盒在 37°C 扩增 25 分钟，最后用 CRISPR-Cas12a 荧光检测或侧向流动分析法检测 RPA 产物。当存在阳性 RPA 产物时，Cas12a/crRNA 复合物就像接到 “指令” 的士兵，结合目标核酸，激活附带切割活性，切割带有荧光基团或生物素的单链 DNA（ssDNA）报告分子，从而产生荧光信号或在侧向流动试纸条上形成检测线。
2. RPA 引物筛选：研究人员精心设计了四对引物，通过 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析 RPA 产物，发现引物 Dh-Cal-F1/Dh-Cal-R1 能特异性扩增 D. helianthi 基因组 DNA，灵敏度最佳，可检测低至 200 pg 的 D. helianthi 基因组 DNA。于是，这对引物成为了后续实验的 “得力助手”，研究人员还根据 RPA 产物设计了 crRNA。
3. RPA/CRISPR-Cas12a 检测优化：研究人员对 RPA 扩增时间、FQ 报告分子浓度、CRISPR-Cas12a 反应时间和 LF 报告分子浓度等条件进行优化。经过多次试验，确定了最佳实验条件，即 RPA 扩增 25 分钟、FQ 报告分子浓度为 0.2 μmol/L、CRISPR-Cas12a 反应 20 分钟、LF 报告分子浓度为 0.2 μmol/L。
4. 特异性：在优化条件下，研究人员对 D. helianthi 和其他病原菌的 DNA 样本进行检测。荧光检测结果显示，只有 D. helianthi 基因组 DNA 产生明显荧光强度；侧向流动试纸条检测也仅 D. helianthi 的 DNA 样本出现明显检测线，这表明该检测方法就像一个精准的 “识别器”，能准确区分 D. helianthi 与其他真菌。
5. 灵敏度：用开发的 RPA/CRISPR-Cas12a 方法检测十倍系列稀释的 D. helianthi 基因组 DNA，结果显示荧光检测法可检测低至 0.1 pg/μL（1.4 copies/μL）的基因组 DNA，侧向流动试纸条法可检测 1 pg/μL（14 copies/μL）的基因组 DNA，而传统实时荧光定量 PCR 只能检测到 10 pg/μL（1.4×102 copies/μL）的基因组 DNA，新方法的灵敏度约为实时荧光定量 PCR 的 100 倍，就像给检测能力装上了 “超级放大镜”。
6. 植物样本适用性：研究人员将 D. helianthi 菌丝体粉末添加到健康向日葵的叶片、茎和种皮等组织中，提取 DNA 后用 RPA/CRISPR-Cas12a 检测。结果表明，荧光检测和侧向流动试纸条法都能检测到混合在植物组织中的 D. helianthi 菌丝体。同时，对接种 D. helianthi 孢子的向日葵幼苗进行检测，发现 RPA/CRISPR-Cas12a 荧光检测法在接种后 5 天就能检测到病原菌，而侧向流动试纸条法和实时荧光定量 PCR 在接种后 10 天才能检测到。

研究结论和讨论部分表明，该研究开发的基于 RPA/CRISPR-Cas12a 的检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高和可视化等优点。灵活的信号读取模式，包括侧向流动试纸条和荧光信号读取，结合便携式恒温金属孵育器，能很好地满足现场检测的便携性要求。与之前报道的实时荧光定量 PCR 方法相比，该方法灵敏度更高或相当，且反应时间短、效率高、操作简单。结合快速核酸提取技术，能够实现对田间样本中病原菌的快速检测，为港口检疫和早期现场诊断提供了一种强有力的新技术。此外，研究还发现以钙调蛋白（Cal）基因为靶点的引物在检测 D. helianthi 时灵敏度最高，表明 Cal 基因在 D. helianthi 基因组 DNA 中可能具有更多拷贝数和保守位点。同时，研究人员建议在实际检测中，由于茎是 D. helianthi 的主要感染部位且检测干扰最小，可将茎作为最佳采样对象。这项研究成果对于防控向日葵茎溃疡病菌的传播、保障向日葵产业的健康发展具有重要意义。