一种 CPC-shelterin-BTR 轴调控有丝分裂端粒去保护机制的发现

为探究有丝分裂端粒去保护机制，研究人员发现 CPC、shelterin 和 BTR 调控轴，揭示了 shelterin 新功能。

　　在细胞的微观世界里，端粒就像染色体末端的 “保护帽”，对维持基因组的稳定性起着至关重要的作用。它能通过形成特殊的结构 —— 端粒环（t-loops），将染色体末端隐藏起来，避免被细胞内的 DNA 损伤监测系统识别，从而防止 ATM 激酶的激活，保护染色体末端不被错误修复或降解。然而，当细胞发生有丝分裂阻滞时，端粒会出现线性化，并引发 ATM 依赖的端粒 DNA 损伤反应（DDR），但这背后的机制一直是个谜。

有丝分裂阻滞相关的端粒去保护（MAD-telomere deprotection）现象更是让这个谜团变得复杂。在正常情况下，细胞的有丝分裂过程有条不紊地进行，但当受到化疗药物、复制压力等因素影响时，有丝分裂会发生阻滞。此时，会出现一种独特的现象 ——MAD-telomere deprotection，即端粒在非端粒相关应激的情况下，被主动去保护。这不仅会促进细胞在有丝分裂期死亡，还会影响后续细胞周期，如导致 p53 依赖的增殖停滞。这一现象为研究端粒保护机制提供了独特的视角，但也带来了许多亟待解决的问题，比如 shelterin 复合体在其中扮演着怎样的角色？t-loop 结构在有丝分裂过程中是如何变化的？

为了揭开这些谜团，来自京都大学研究生院生物研究科、悉尼大学儿童医学研究所等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解端粒保护和去保护机制带来了新的突破。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。他们利用基于邻近生物素化的无偏蛋白质组学技术，筛选在有丝分裂阻滞时与端粒相互作用的蛋白质；通过免疫共沉淀（co-IP）技术，验证蛋白质之间的相互作用；借助 RNA 干扰（RNAi）技术，敲低特定基因的表达，以探究基因功能；使用超分辨率成像技术，观察端粒的微观结构变化；运用质谱分析技术，鉴定蛋白质及其修饰位点。通过这些技术的综合运用，研究人员从多个层面解析了有丝分裂端粒去保护的机制。

在研究结果部分，研究人员首先发现 TRF1 在有丝分裂阻滞时与 CPC 和 BLM 相互作用。通过无偏蛋白质组学筛选，他们发现有丝分裂阻滞时，103 种蛋白质可能与 Flag-APEX2-TRF1 特异性相互作用，其中包括 CPC 的部分成员和 BLM。免疫共沉淀实验进一步证实，在多种人类细胞系中，TRF1 在有丝分裂阻滞时与 AURKB、BLM 存在相互作用，且 BLM 对 MAD 端粒去保护起促进作用。

接着，研究人员发现 AURKB 磷酸化 TRF1 促进 MAD 端粒去保护。敲低 TRF1 可抑制 MAD-TIF 形成，而野生型 TRF1 能挽救这一表型，携带 BLM 结合基序缺失的 TRF1ΔBLM 则不能。对 TRF1 潜在磷酸化位点的研究表明，Ser354 和 Thr358 是 AURKB 磷酸化位点，其突变会影响 MAD-TIF 形成，且 AURKB 可在体外磷酸化 TRF1，这些都说明 TRF1 在 MAD 端粒去保护中起重要作用，且其功能受 AURKB 磷酸化调控。

随后，研究发现磷酸化的 TRF1 通过 Survivin 招募 CPC。合成的磷酸化 TRF1 肽段进行蛋白质沉淀实验，结果显示，pTRF1-S354 和 pTRF1-T358 肽段样本中 CPC 的 Survivin 成分富集。细胞实验也证实，TRF1 铰链区缺失或 S354 和 T358 双突变会减弱 TRF1 与 CPC 各组分的相互作用，而模拟磷酸化的 TRF2-2D 可部分挽救这种相互作用，这表明 AURKB 磷酸化 TRF1 铰链区可促进 TRF1 与 CPC 通过 Survivin 相互作用，多个 CPC 亚基对 MAD-TIF 形成不可或缺。

AURKB 磷酸化 TRF2 基本结构域促进 MAD 端粒去保护也是重要的研究发现。研究人员预测 AURKB 可能修饰 TRF2，经实验验证，在有丝分裂阻滞时，AURKB 可磷酸化 TRF2 的 Ser62 和 Ser65。敲低 TRF2 会导致细胞出现更多的间期和中期 TIF，过表达野生型 TRF2 可抑制 TIF 形成，而 TRF2-S65D 可促进中期 TIF 形成，这表明 TRF2 基本结构域参与有丝分裂特异性端粒保护，其保护能力可通过 TRF1 和 AURKB 依赖的修饰减弱。

在对 TRF2 基本结构域修饰促进 MAD t-loop 打开的研究中，利用超分辨率显微镜观察发现，在有丝分裂阻滞时，表达 hTRF2-2A 或 hTRF2-2D 的细胞中，t-loop 结构减少，这说明 TRF2 基本结构域的修饰会影响 t-loop 结构，促进其打开，进而导致端粒线性化和 DDR 激活。

研究人员还证实 BTR 活性对 MAD 端粒去保护至关重要。通过敲低 BLM 并表达其突变体，研究发现 BLM 的解旋酶活性和与其他 BTR 组分的相互作用对 MAD-TIF 形成至关重要，敲低 BTR 其他组分或表达 TOP3A 的酶失活突变体，也会抑制 MAD-TIF 形成，这表明 BTR 催化活性与 MAD 端粒去保护密切相关。

最后，研究表明 TRF2 修饰影响 MAD 致死率。通过对表达不同 TRF2 突变体的细胞进行活细胞成像分析，发现促进 MAD-TIF 的 TRF2-S65D 会增加细胞在有丝分裂期的死亡，而抑制 MAD-TIF 的 TRF2-WT 和 TRF2-S65A 可减少细胞死亡，这说明 AURKB 依赖的 TRF2 磷酸化可促进有丝分裂死亡事件。

综合研究结果和讨论，研究人员发现了一种由 CPC、shelterin 和 BTR 调控的 MAD 端粒去保护机制。在有丝分裂阻滞时，AURKB 磷酸化 TRF1，促进 CPC 与 TRF1 结合，进而磷酸化 TRF2，使 t-loop 结构被 BTR 溶解，导致端粒线性化和 ATM 依赖的 DDR 激活，最终促进细胞在有丝分裂期死亡或 p53 依赖的 G1 期阻滞。这一发现揭示了 shelterin 功能的复杂性，表明其不仅参与端粒保护，还在端粒去保护过程中发挥重要作用。这为深入理解细胞有丝分裂过程中端粒的动态变化提供了理论依据，也为相关疾病的治疗和干预提供了潜在的靶点和思路。