比较基因组学：探秘楝科植物生物地理与生化多样性的钥匙

为解析楝科植物柠檬苦素下游修饰基因，研究人员开展基因组研究，揭示其生物地理和生化多样性。

　　# 楝科植物研究：解锁生物地理与生化多样性密码
在植物的奇妙世界里，楝科植物如印楝（Azadirachta indica）和苦楝（Melia azedarach）一直备受关注。它们富含具有独特抗虫活性的柠檬苦素（limonoids），这些柠檬苦素就像是植物的 “秘密武器”，不仅能帮助植物抵御害虫侵害，还在医药领域展现出巨大的潜力。然而，长期以来，科学家们对柠檬苦素下游修饰的相关基因却知之甚少。已有的楝科植物基因组版本存在许多未闭合的缺口和组装错误，缺乏单倍型解析的端粒到端粒（T2T）组装，这严重阻碍了对楝科植物深入研究的脚步，就像拼图缺少了关键的几块，无法完整呈现其全貌。

为了填补这些知识空白，中国中医科学院中药研究所（State Key Laboratory for Quality Ensurance and Sustainable Use of Dao-di Herbs, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences）的研究人员勇挑重担，开展了一项意义重大的研究。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们深入了解楝科植物打开了新的大门。

研究人员运用了多种先进的技术方法来推动研究进展。在测序技术方面，利用 PacBio、Oxford Nanopore Technologies（ONT）和 Hi-C 等技术对印楝和苦楝进行测序，获取了大量高质量的基因数据。通过这些数据，使用 HiFiasm 等软件进行混合组装，最终成功将印楝和苦楝的基因组组装提升到 T2T 水平。同时，借助系统发育分析、转录组测序（RNA-seq）、加权基因共表达网络分析（WGCNA）等技术，深入挖掘基因功能和物种间的遗传关系。在功能验证环节，运用体外实验和烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时表达等技术，确定关键基因的功能。

研究结果

1. 基因组组装与分析：研究人员利用 HiFiasm 软件，结合 HiFi、ONT 和 Hi-C 数据，成功为印楝和苦楝各自组装出 13 条单倍型解析的 T2T 染色体。新发现的 rDNA 染色体在以往研究中被忽视，此次研究对其进行了完整组装。经过评估，基因组的完整性和连续性得到显著提升，碱基质量值（QV）超过 60，BUSCO 评估显示基因组完整性大于 99.5%。通过与现有基因组对比，有效填补了以往基因组中的空白。在基因注释方面，印楝和苦楝基因组中重复序列分别占 32.14% 和 32.10%，注释出的基因数量分别为 28215 和 28889 个。系统发育分析表明，楝科植物在无患子目（Sapindales）中形成独立分支，印楝和苦楝染色体具有高度共线性，但香椿（Toona sinensis）和大叶桃花心木（Swietenia macrophylla）经历了全基因组复制事件。
2. 核型进化与物种形成：印楝原产于印度次大陆的阿萨姆邦，苦楝原产于中国西南部的四川省，喜马拉雅 - 横断山脉的阻隔使得二者基因交流受限，形成地理隔离。研究人员通过基因组比较分析发现，印楝和苦楝染色体高度保守且共线，仅印楝 12 号染色体存在 1.08Mb 的末端倒位。与外类群物种比较确认该倒位仅存在于印楝谱系，这一倒位可能通过限制基因流，推动了印楝和苦楝的异域物种形成。通过计算直系同源基因对的分化程度，推测印楝和苦楝大约在 1800 万年前（MYA）开始分化，这一结果与太平洋海沟快速迁移停止时间相吻合，为青藏高原地质演化提供了生物视角的证据。
3. 含硫挥发物生物合成相关基因的扩张：楝科植物中，香椿和印楝等含有具有大蒜气味的含硫挥发物。研究发现，γ- 谷氨酰转肽酶（GGT）基因在楝科植物中显著扩张，印楝和苦楝的 GGT 基因拷贝数分别为 16 和 14，而柑橘（C.sinensis）仅有 1 个拷贝。在香椿基因组中也检测到 GGT 基因的扩张，但四倍体大叶桃花心木基因组中只有 1 个拷贝，表明该基因扩张发生在楝科物种辐射过程中。对不同物种叶片中 S - 烯丙基半胱氨酸含量的测定结果显示，其含量排序为香椿 > 印楝 > 苦楝 > 柑橘，与 GGT 基因拷贝数相符，说明 GGT 基因的扩张可能与楝科植物含硫挥发物的积累有关。
4. 柠檬苦素生物合成中酰基转移酶的扩张：楝科植物富含具有抗虫活性的柠檬苦素，尽管原柠檬苦素生物合成研究取得一定进展，但从阿扎迪酮（azadirone）到川楝素（toosendanin）或印楝素（azadirachtin）的完整生物合成途径仍不明确。研究人员对印楝和苦楝的酰基转移酶（AT）家族基因进行研究，发现苦楝中 AT 基因数量为 39 个，高于其他相关物种。在印楝和苦楝的 3 号染色体上分别鉴定出 9 个和 15 个 AT 基因的串联簇，而外类群物种中拷贝数较少，表明该串联扩张发生在楝科物种辐射之后、印楝和苦楝分化之前。通过转录组测序和 WGCNA 分析，发现苦楝果实相关基因模块中多个基因与乙酰化功能相关，其中 3 号染色体上的 AT 基因串联簇表达模式在果实中差异显著，推测这些 AT 基因在果实中的不同表达水平可能导致印楝和苦楝柠檬苦素乙酰化多样性。
5. 柠檬苦素 C₁₂-OH 酰化的 ATs 功能鉴定：由于印楝和苦楝柠檬苦素在 C₁₂位置的酰化存在差异，研究人员选取苦楝 6 个和印楝 4 个高表达的 AT 基因进行体外功能验证。结果表明，苦楝的 MaAT8824 和 MaAT1704 能够将乙酰基转移到柠檬苦素的 C₁₂-OH 基团上，生成川楝素和异川楝素，而印楝的同源基因 AiAT0635 不具备该活性。进一步研究发现，MaAT8824 和 MaAT1704 对 C₁₂-OH 和 C₃-OH 基团均具有乙酰化活性，但更倾向于 C₁₂-OH 基团。在体内实验中，烟草叶片瞬时表达实验也证实了这一结果。对不同组织中相关化合物含量的测定发现，底物主要存在于印楝和苦楝果实中，而乙酰化产物仅在苦楝中检测到，且果实中含量最高，这与转录组和酶学实验结果一致。
6. MaAT8824 的催化机制：由于 MaAT8824 具有较高催化活性，研究人员对其催化机制进行深入研究。通过分子对接和分子动力学（MD）模拟，发现 MaAT8824 对 C₁₂-OH 的优先催化作用源于酰基 C 与底物氧阴离子之间相对较短的距离以及乙酰辅酶 A（Acetyl-CoA）的稳定结合。动力学分析表明，MaAT8824 对不同底物的催化效率存在差异，对含有乙酰基的底物催化活性更高，且对 C₁₂-OH 的底物催化活性高于 C₃-OH 的底物，底物偏好顺序为化合物 1 > 3 > 6 > 5，与 MD 分析结果一致。通过定点突变实验，确定了关键氨基酸残基在底物特异性中的作用，如 C32A、H33A 和 W377A 等突变体对不同底物的反应速率发生显著变化。
7. 关键区域驱动 AiAT0635 功能获得：MaAT8824 和 MaAT1704 的新功能化以及印楝中无功能的 AiAT0635 存在，为研究关键功能区域提供了契机。通过序列比对，发现 MaAT8824 和 AiAT0635 在 N 端 7 个氨基酸区域存在显著差异。将 AiAT0635 的该区域替换为 MaAT8824 的对应区域后，突变体 AiAT0635-8824-F1 获得乙酰化活性，能够催化生成川楝素，而其他突变体无此活性。MD 模拟显示，突变后底物在 AiAT0635 中的相对位置发生改变，乙酰辅酶 A 的结合更稳定，从而解释了突变体功能获得的机制，但由于底物与酶的结合距离未发生显著变化，导致其催化活性仍低于 MaAT8824。

研究结论与讨论

这项研究成果意义非凡。研究人员成功获得印楝和苦楝的 T2T 基因组组装，揭示了二者在约 1800 万年前因喜马拉雅 - 横断山脉的隆起而发生异域物种形成，为青藏高原地质演化提供了独特的生物学证据。同时，鉴定出参与柠檬苦素生物合成和分化的关键乙酰转移酶基因，解析了其催化机制和底物特异性，为深入理解柠檬苦素生物合成途径和楝科植物生化多样性的遗传基础提供了重要依据。然而，研究也存在一些待探索的方向，如 MaAT8824 更广泛的受体谱、其晶体结构对催化机制的进一步阐释等。未来，随着研究的不断深入，有望为楝科植物的开发利用，如新型农药和药物的研发，提供更坚实的理论基础。