中国细辛叶斑病病原菌的鉴定及致病因子预测：揭示细辛病害新机制

　　在广袤的中国大地，细辛（Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim.) Kitag）作为一种珍贵的多年生药用草本植物，备受关注。它的根含有甲基丁香酚、黄樟素等挥发油成分，在驱散风寒、润肺化痰、缓解疼痛等方面效果显著，是中医常用药材。在东北辽宁等地，细辛的人工种植规模不断扩大，然而，如同其他农作物一样，细辛在生长过程中也遭遇了重重 “危机”。近年来，各种病害接踵而至，其中叶斑病尤为严重，给细辛的种植带来了巨大挑战。据 2022 年数据显示，在新宾这个核心产区，细辛叶斑病平均病田率高达 75.2%，病株率为 28.5%，估计损失率约 5.0% 。面对这一严峻形势，为了保障细辛的产量和质量，深入研究叶斑病的病因并找到有效的防治策略迫在眉睫。

辽宁省农业科学院经济作物研究所的研究人员勇挑重担，开展了一项关于细辛叶斑病的研究。研究成果发表在《Scientific Reports》上，为解决细辛叶斑病问题带来了新的曙光。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是病原菌分离技术，从 2022 年田间采集的 25 株患病细辛叶片样本出发，经过消毒处理后，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上进行培养，再通过单孢分离法获得纯化菌株。其次是分子鉴定技术，提取菌株 DNA 后，利用特定引物对内部转录间隔区（ITS）、大亚基（LSU）、β 微管蛋白（tub2）和第二大 RNA 聚合酶亚基（rpb2）基因进行 PCR 扩增和测序。然后是系统发育分析，借助 MEGA-X、PhyloSuite 等软件，采用最大似然法（ML）、邻接法（NJ）和贝叶斯推断法（BI）构建系统发育树，确定病原菌种类。此外，还有形态学鉴定，观察病原菌在不同培养基上的菌落形态、细胞特征等。最后，通过生物信息学分析，在病原菌 - 宿主相互作用数据库（PHI-base）中查询相关致病蛋白，并利用本地 BLASTP 分析预测致病因子，构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络进行功能富集分析。

研究结果主要包括以下几个方面：

• 真菌分离：从 25 株患病植株中分离得到 37 株真菌，经初步筛选，保留 7 株 Didymella 属菌株进行后续研究，选取 Xy0531 - 4 菌株作为代表菌株。
• 系统发育分析：基于 ITS 序列的系统发育分析发现，该分析所纳入的菌株节点支持值未达理想阈值。而多基因系统发育分析结果显示，7 株菌株与 D. segeticola 参考菌株形成统一分支，在贝叶斯推断（后验概率 = 0.82）、邻接法（自展支持率 = 95%）和最大似然法（自展支持率 = 75%）分析中均得到有力支持，表明这些菌株与 D. segeticola 的亲缘关系密切。结合菌落形态和致病性初步研究，确定这 7 株菌株属于同一致病种，即 D. segeticola。
• 形态学鉴定和致病性测试：代表菌株 Xy0531 - 4 在不同培养基上呈现出不同的菌落特征。在 PDA 培养基上，菌落直径达 53.0 ± 0.6mm，边缘不规则，气生菌丝紧密，颜色由白转铁灰色，背面颜色从灰色到深棕色；在麦芽提取物琼脂（MEA）培养基上，菌落直径 36.1 ± 0.5mm，边缘规则，气生菌丝呈絮状奶油白色，中心绿灰色，背面颜色一致；在燕麦琼脂（OA）培养基上，菌落直径 59.8 ± 0.8mm，边缘规则，气生菌丝绒毛状，颜色从边缘白色逐渐过渡到中心灰色，背面呈灰橄榄色；在肌酸蔗糖琼脂（CREA）培养基上，菌落直径 63.7 ± 0.6mm，边缘不规则，菌丝平铺，气生菌丝稀疏且不产酸。细胞特征方面，未观察到有性阶段，分生孢子器黑色，球形至椭圆形，多数融合，直径 70 - 120μm，后期形状不规则，周围有大量菌丝生长；分生孢子椭圆形至卵形或圆柱形，光滑、无隔膜，通常有油滴，大小为 3.0 - 8.7 × 1.2 - 3.6μm ；在 OA 培养基上培养 14 天后可观察到厚垣孢子。致病性测试结果表明，接种 Xy0531 - 4 菌株的细辛叶片出现典型的叶斑症状，而空白对照组无症状，进一步证实 D. segeticola 是细辛叶斑病的病原菌。
• 致病因子预测和 PPI 网络分析：依据 PHI - base 数据库，研究人员在 D. segeticola 参考基因组中鉴定出 87 种推定的致病因子蛋白序列，这些因子可分为致死（54 种，62.1%；基因：TOXA）、增强毒力（19 种，21.8%；基因：ChVel1 和 ChLae1）和效应子（14 种，16.1%；基因：SRE1、Cgfl、StACE1 和 RsRplA）三类。PPI 网络和 k - 均值聚类分析显示，不同表型的致病因子在相互作用模式上具有显著的表型特异性，形成了不同的功能模块。例如，致死相关的致病因子主要集中在不饱和脂肪酸生物合成和鞘脂从头生物合成相关的模块；增强毒力的致病因子主要存在于涉及类固醇生物合成和甲基转移酶结构域的混合功能模块；效应子相关的致病因子则集中在几丁质分解代谢相关途径的模块。富集分析还发现，不同类别的致病因子在分子特征上存在差异，致死相关致病因子与膜、跨膜转运蛋白活性、ATP 结合盒（ABC）转运蛋白途径密切相关；增强毒力的致病因子与孢子形成、碳氮连接酶活性、丙酸盐代谢途径和泛素介导的蛋白水解途径相关；效应子相关致病因子与膜和细胞器膜、几丁质结合和几丁质酶活性、几丁质分解代谢过程和多糖分解代谢过程以及氧化磷酸化途径和氨基糖和核苷酸糖代谢途径相关。

研究结论和讨论部分表明，D. segeticola 是中国东北地区细辛叶斑病的新病原菌，这一发现拓展了该病原菌已知的地理分布和宿主范围。通过系统发育和形态学分析明确了其致病身份，生物信息学技术预测了潜在的致病因子，为深入了解 D. segeticola 的致病机制提供了重要线索。预测的 87 种致病效应子，按照功能可分为效应子（植物无毒决定因子）、增强毒力和致死表型相关因子，这些结果有助于揭示 D. segeticola 的致病分子机制，为后续研究奠定了理论基础。然而，目前一些致病相关基因在 D. segeticola 中的生物学功能尚未明确，如 TOXA 基因。未来研究可聚焦于这些预测效应子的功能验证，将研究成果应用于细辛抗病品种的选育，以及开发环境可持续的防治策略，以应对这一新兴植物病原菌带来的挑战，保障细辛产业的健康发展。<【中国细辛叶斑病病原菌的鉴定及致病因子预测：揭示细辛病害新机制】【为探究细辛叶斑病病因，研究人员鉴定出 D. segeticola 是病原菌并预测其致病因子，为病害防治奠基。】【细辛 | 叶斑病 | Didymella segeticola | 病原菌鉴定 | 致病因子预测 | 多基因系统发育分析 | 形态学鉴定 | 致病性测试 | 生物信息学分析 | ABC 转运蛋白】【国内】【在植物的世界里，细辛这种多年生药用草本植物，宛如一颗珍贵的明珠。它是中医里的 “好帮手”，根中富含甲基丁香酚、黄樟素等挥发油，有着驱散风寒、润肺化痰、缓解疼痛的神奇功效。在我国辽宁等地，细辛的人工种植规模越来越大，本应是一片繁荣景象，可谁能想到，一场 “危机” 悄然降临。

近年来，细辛遭遇了多种病害的侵袭，其中叶斑病尤为严重。在 2022 年，新宾这个核心产区，平均病田率达到 75.2%，病株率为 28.5%，估计损失率约 5.0% 。这不仅让种植户们忧心忡忡，也给细辛产业带来了巨大的冲击。为了拯救细辛，解开叶斑病的谜团，辽宁省农业科学院经济作物研究所的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为解决这一难题带来了希望之光。

研究人员在这次研究中使用了一系列关键技术。他们先从田间采集了 25 株患病细辛的叶片，通过病原菌分离技术，在培养基上培养并纯化菌株。接着进行分子鉴定，提取菌株 DNA，用特定引物对 ITS、LSU、tub2 和 rpb2 基因进行扩增和测序。然后借助多种软件，采用最大似然法、邻接法和贝叶斯推断法进行系统发育分析，确定病原菌的种类。同时，通过观察病原菌在不同培养基上的生长表现进行形态学鉴定。最后，利用生物信息学分析，在数据库中查找相关致病蛋白，预测致病因子并构建网络进行功能分析。

研究结果十分丰富：

• 真菌分离：从患病植株上分离出 37 株真菌，经过筛选，留下 7 株 Didymella 属菌株，其中 Xy0531 - 4 菌株被选为代表菌株。
• 系统发育分析：一开始基于 ITS 序列的分析，菌株节点支持值不太理想。但多基因系统发育分析发现，7 株菌株和 D. segeticola 参考菌株形成了一个分支，在多种分析方法下都得到了有力支持，这说明它们和 D. segeticola 关系很近。结合其他研究，确定这 7 株菌株就是 D. segeticola。
• 形态学鉴定和致病性测试：Xy0531 - 4 菌株在不同培养基上表现出不同的样子。在 PDA 培养基上，菌落直径 53.0 ± 0.6mm，边缘不规整，颜色有变化；在 MEA 培养基上，菌落直径 36.1 ± 0.5mm，边缘规则；在 OA 培养基上，菌落直径 59.8 ± 0.8mm，气生菌丝有特点；在 CREA 培养基上，菌落直径 63.7 ± 0.6mm，菌丝生长情况特殊。细胞特征方面，没发现有性阶段，分生孢子器、分生孢子和厚垣孢子都有各自的特征。致病性测试中，接种该菌株的细辛叶片出现叶斑症状，而空白对照没有，证明 D. segeticola 就是细辛叶斑病的病原菌。
• 致病因子预测和 PPI 网络分析：研究人员在 D. segeticola 参考基因组里找到了 87 种可能的致病因子蛋白序列，分成致死、增强毒力和效应子三类。通过分析发现，不同类型的致病因子在相互作用模式上有明显差异，形成了不同的功能模块。而且不同类别的致病因子在分子特征上也不一样，和不同的生物学过程、代谢途径相关。

总的来说，这项研究发现 D. segeticola 是中国东北地区细辛叶斑病的新病原菌，扩大了它的地理和宿主范围。通过多种分析方法确定了它的致病身份，还预测了致病因子，这对了解它的致病机制很有帮助。虽然还有一些致病基因的功能不清楚，但为后续研究指明了方向。未来可以进一步研究这些效应子的功能，用于选育抗病品种，制定更环保的防治策略，保护细辛产业的发展。